[发明专利]真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用

说明书

本发明涉及α‑L‑鼠李糖苷酶的应用技术，特别涉及一种真菌来源的α‑L‑鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，包括如下步骤：步骤一、AmRhaE基因合成及重组表达α‑L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建；步骤二、50mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α‑L鼠李糖苷酶；步骤三、5L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α‑L鼠李糖苷酶；步骤四、重组大肠杆菌全细胞催化水解淫羊藿提取物样品；还可以包括步骤五、重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品；本发明通过将编码α‑L‑鼠李糖苷酶的基因序列连接至大肠杆菌表达载体pET28a上，在大肠杆菌宿主BL21(DE3)进行诱导表达。以0.5mMIPTG25℃诱导12h，获得重组酶酶活力为32U/mL，通过5L发酵罐优化放大，以0.5mMIPTG诱导12h，获得重组酶酶活力达197U/mL，相比于放大化表达前，酶活提高了6.15倍。

技术领域

本发明涉及α-L-鼠李糖苷酶的应用技术，特别涉及一种真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是能特异性水解鼠李糖苷键的一种水解酶，广泛分布在自然界中的微生物，在细菌(芽孢杆菌属、乳杆菌属、单胞菌属等)以及真菌(曲霉、木霉、青霉等)中均有α-L-鼠李糖苷酶。α-L-鼠李糖苷酶可高效水解多种含有α-鼠李糖苷键的糖苷类物质，例如人参皂苷、柚皮苷、芦丁、橙皮苷以及朝藿定C等。

α-L-鼠李糖苷酶被广泛地应用在食品、医药等领域。食品工业中，α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶和橙皮苷酶的主要活性成分，能够有效改善柑橘类果汁风味，去除苦味。且在酿酒工业中能明显提升酿酒过程中香味物质的比例。α-L-鼠李糖苷酶的应用极大地提升了软硬饮料的品质。在医疗与保健领域中，由于受到糖苷键的影响许多黄酮类化合物生物利用率比较低，而通过α-L-鼠李糖苷酶对黄酮类化合物苷进行水解，增加了黄酮类葡萄糖苷含量，更利于生物活性物质的吸收。

淫羊藿苷为小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)、箭叶淫羊藿(EpimediumsagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)或朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥茎叶提取物。分子式C33H40015，分子量676.65，CAS号489-32-7。

淫羊藿苷有多种药理作用，并且其水解产物淫羊藿苷元已作为中药一类抗癌新药获批国家临床批件，并进入快速审批程序，并被多位权威专家认为是在中药现代化研究中，继青蒿素之后的又一重大成果。但淫羊藿苷元在淫羊藿属植物体内含量极低，现确实可行的获得方式为通过淫羊藿苷水解获得淫羊藿苷元。然而天然环境中，在淫羊藿草中淫羊藿苷的比例一般在2％以下，相对而言，朝藿定C的含量会比淫羊藿苷更丰富，通常是淫羊藿苷含量的5～6倍。通过水解朝藿定C可以制备淫羊藿苷。可采用生物酶促法催化含量较高的朝藿定C脱去一分子的鼠李糖转化为淫羊藿苷。因此研究淫羊藿苷的大规模工业生产并且环境友好的制备工艺，面对淫羊藿苷元的市场需求，极具现实意义。

生物催化法制备淫羊藿苷，因其步骤简单，条件温和，环境友好，具有很高的经济价值。生物催化法以淫羊藿苷粗提物为底物，α-L-鼠李糖苷酶水解除去朝藿定C的α-1,2鼠李糖苷键连接的末端鼠李糖，生成产物淫羊藿苷。但利用现有的α-L-鼠李糖苷酶酶催化淫羊藿苷粗提物，朝藿定C的转化率还不尽如人意。中国专利文献CN110066760A(申请号CN201910435031.2)公开了，重组AnRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品，于37℃进行催化反应90min可将朝藿定C完全转化为淫羊藿苷，但其转化的浓度与效率离工业化生产还有一定的距离。因此挖掘一种在混合样品中高效催化朝藿定C生成淫羊藿苷的酶，以指导大规模工业化生产淫羊藿苷极具社会价值。

发明内容

针对背景技术中提到的问题，本发明的目的是提供一种真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，以解决背景技术中提到的问题。