[发明专利]一种结核病血清标志物筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种结核病血清标志物筛选方法，结核病患者血清(实验组)、健康人血清(对照组)分别进行仿生亲和或亲和层析，制备实验组仿生亲和或亲和层析抗体柱、制备对照组仿生亲和或亲和层析抗体柱；将结核杆菌培养滤液或结核杆菌胞浆蛋白分别与实验组、对照组仿生亲和或亲和层析抗体柱层析；分析与上述实验组和对照组血清抗体结合的结核杆菌蛋白，初步获得结核病检测的血清标志物；进一步方法分析上述初选结核病检测血清标志物。这种方法采用仿生亲和色谱、抗原‑抗体特异识别、质谱分析、生物信息学分析方法相结合方式，实现结核患者血清标志物的高通量筛选与评估。解决了现有技术筛选结核病血清标志物方法的局限性。

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，具体涉及结核病血清标志物的筛 选方法以及这种方法在结核病血清诊断领域的应用。

背景技术

结核病(TB)是结核杆菌(MTB)感染机体引起的单一致病死 亡率最高的传染病之一，肺结核病人占患者总数的90％。目前对 结核病血清标志物研究是单独的、非特异性的研究模式；存在以 下局限性：(1)在外源大肠杆菌(E.coli)宿主细胞中约50％结核 分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB)蛋白不能表达，导致此类蛋白 在血清标志物筛选时被遗漏。(2)大量MTB重组蛋白表达与分 离纯化过程费时费力，且其中绝大多数重组表达蛋白并非理想的 血清标志物。(3)外源表达MTB蛋白的活性容易受到表达宿主 本身性质的影响；(4)识别MTB蛋白的是患者总血清，因血清 全蛋白成分非常复杂，存在非特异性结合的可能性极大，因此容 易导致检测结果假阳性。

为了解决现有技术中对结核病血清标志物的筛选存在的局 限，需要一种有效的筛选方法。

发明内容

本发明公开了一种结核病血清标志物的筛选方法，这种方法 采用仿生亲和或亲和色谱特异吸附血清抗体、抗原(结核杆菌抗 原)-抗体特异识别、质谱分析、生物信息学分析方法相结合方 式，实现结核患者血清标志物的高通量筛选。解决了现有技术筛 选结核病血清标志物方法的局限性。

另外，本发明还公开了筛选方法的应用，提高了结核病的诊 断准确性。

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种结核病血清标志物筛选方法，包括以下步骤：

a、将实验组的血清蛋白进行仿生亲和或亲和层析，制备实验组 仿生亲和或亲和层析抗体柱；将对照组的血清蛋白进行仿生亲和或亲 和层析，制备对照组仿生亲和或亲和层析抗体柱；

b、制备结核杆菌培养滤液蛋白或结核杆菌细胞浆蛋白，将结核 杆菌培养滤液或结核杆菌细胞浆蛋白分别与实验组仿生亲和或亲和 抗体层析柱层析、用相同的结核菌蛋白样本与对照组仿生亲和层析柱 或亲和层析柱层析；

c、洗脱步骤b完成后的层析柱，然后对洗脱组分进行液相色谱- 质谱分析；

d、通过液相色谱-质谱分析实验组、对照组组分中与血清抗体结 合的结核杆菌培养滤液或结核杆菌胞浆蛋白。

e、检索结核杆菌蛋白质组学数据库获取具体的每一种蛋白的基 本生化信息；将分析实验组结合的结核杆菌培养滤液或结核杆菌细胞 浆蛋白与对照组结合的结核杆菌蛋白相对比，扣除结合在对照组的结 核菌蛋白，最终构建结核菌杆血清标志物蛋白库；

f、对构建的结核病血清标志物库中的蛋白进行质谱数据分析、 生物信息学分析与免疫学分析，得到结核病血清标志物。

进一步,对步骤f中所得结核病血清标志物库中的蛋白通过基因 工程表达与分离纯化后，接着用抗原-抗体特异识别的免疫学方法， 该方法包括但不限于间接酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immune-sorbent Assay,ELISA)评估，验证筛选的结核病血清标志物的敏感性与特异性。

本发明的实验组血清来自结核患者，对照组血清来自健康体 检者。