[发明专利]一种用于检测细胞角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种用于检测细胞角蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）3,4,9,10-苝四羧酸纳米棒的制备

首先，将10 ~15 mg苝四羧酸二酐溶解在10 ~ 15 mL浓度为1 M的氢氧化钠水溶液中，然后加热溶液直至苝四羧酸二酐完全溶解并且溶液颜色变为黄绿色；随后，将1 M的盐酸加入上述黄绿色溶液中直至混合物的颜色完全变为红色；离心洗涤收集产物，沉淀用无水乙醇和超纯水交替洗涤，直至pH为7.4，产物沉淀在25 ℃下真空干燥，得到3,4,9,10-苝四羧酸纳米棒；

（2）二硫化锡纳米管的制备

二硫化锡纳米管是通过溶剂热法合成的，将0.7 ~ 0.8 g五水合四氯化锡和0.3 ~ 0.4g硫代乙酰胺溶解在60 ~ 70 mL异丙醇中，并加入0 ~ 20 g十二烷基苯磺酸钠和0 ~ 5 g十六烷基三甲基溴化铵，室温下剧烈搅拌30 min后，将其转移到聚四氟乙烯的高压釜中，在160 ~ 180 ℃下加热22 ~ 24 h，反应釜自然冷却至室温后，收集金色沉淀物，并将沉淀物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥12 h，得到二硫化锡纳米管；

（3）硫铟铜微米花的制备

取0.1 ~ 0.2 g氯化亚铜与0.2 ~ 0.3 g三氯化铟溶解于40 ~ 50 mL乙二醇中，将其转入聚四氟乙烯的高压反应釜，于200 ~ 220 °C反应20 ~ 24 h，反应结束后自然冷却至室温，所得产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，于80 ~ 100 °C下干燥10 ~ 12 h，得到硫铟铜微米花；

（4）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的配置

取0.5 ~ 0.8 g三羟甲基氨基甲烷与2 ~ 3 g氯化钠与0.2 ~ 0.6 g氯化钾定容于250mL的容量瓶中配置成溶液A，取300 ~ 1200 μL浓盐酸稀释成10 ~ 25 mL浓度为1 ~ 3 M盐酸为溶液B，用溶液B调节溶液A的pH，配置成pH在5.0 ~ 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐冲溶液；

（5）亲和素-硫铟铜杂化物的制备

将50 ~ 60 mg硫铟铜分散在40 ~ 50 mL乙醇和水体积比为191的溶剂中，

然后，将 1 ~ 2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入硫铟铜悬浮液中，混合悬浮液超声20~ 30 min，将其在70 ~ 100 °C下加热1 ~ 2 h，冷却后将悬浮液用乙醇离心洗涤3次，在60℃下干燥，得到氨基功能化的硫铟铜；

取10 ~15 mg氨基功能化硫铟铜分散在2 ~ 4 mL的pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中并注入10 μL质量分数为2.5 %戊二醛溶液，在室温下孵育2 h；将所得混合物分散在1 mL pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中形成悬浮液，之后，将100 ~200 μL浓度为1~ 2 mg/mL抗生素蛋白加入悬浮液中，并在4 °C下孵育1 h；最后，洗涤后，再分散于2 ~ 4 mL pH为4 ~ 6含有1 %牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中，得到亲和素-硫铟铜杂化物；

（6）抗体-生物素免疫杂化物的制备

交联剂为含有5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，将10 ~ 20 μL交联剂分散在1 ~ 2 mL浓度为1 μg/mL抗体溶液中，然后加入200 ~ 400 μL 浓度为1 mg/mL加入生物素酰肼溶液，所得溶液在室温下震荡2 h，得到抗体生物素免疫杂化物，在4 ℃冰箱中保存以备后用；

（7）光电化学免疫传感器的制备

将ITO导电玻璃电极依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气氛围下烘干；

取10 µL、1 ~ 5 mg/mL的3,4,9,10-苝四羧酸悬浮液滴加到ITO导电玻璃电极，室温下自然晾干；

在修饰的电极表面滴加10 µL、1 ~ 5 mg/mL的二硫化锡悬浮液，室温下自然晾干；

在修饰电极表面滴加体积比为1:1的5 ~ 10 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 ~ 5 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液4 μL，室温下自然晾至湿润薄膜状态；

滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL的细胞角蛋白抗原，室温下自然晾至湿润薄膜状态，后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液冲洗ITO导电玻璃电极；

滴加3 µL、用pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液配置的质量分数为1% ~3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，4 ℃冰箱中晾干，之后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液冲洗ITO导电玻璃电极；

滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL的细胞角蛋白抗体-生物素溶液，4 ℃冰箱中自然晾干，后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液冲洗ITO导电玻璃电极；

滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL所制备的亲和素-硫铟铜水溶液4 ℃冰箱中自然晾干，后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液冲洗电极；制得一种检测细胞角蛋白的光电化学传感器。

2.如权利要求1所述制备方法制备得到的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，银/氯化银电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO导电玻璃电极为工作电极，在10 mL、pH 5.0 ~ 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，0.01 ~ 0.5 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对细胞角蛋白抗原进行检测，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间60 s，光源波长为400 ~ 450 nm；

（3）电极放置好之后，每隔10 s开光源持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；

（4）将待测的细胞角蛋白抗原样品溶液代替细胞角蛋白抗原标准溶液进行检测。