[发明专利]一种靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的基因编辑方法。本发明提供的方法是利用根据尾叶桉CAD基因设计靶位点gRNA1和gRNA2，通过基因编辑靶向切除尾叶桉CAD基因编码区片段。本发明提供的基因编辑方法靶向性强，可应用于桉树基因编辑育种，为进一步创制CAD敲除突变体提供研究基础。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及尾叶桉CAD基因编码区DNA的靶向切除。

背景技术

桉树是世界三大速生树种之一，中国引种桉树已有100多年历史，逐渐发展成为南方人工林种植与加工利用的主导树种。近年来许多国际大型造纸企业竞相在两广、海南地区投产建厂，纸浆材需求急速攀升。尾叶桉(Eucalyptus urophylla)具有木材纤维素含量较高，木质素、热水抽出物含量低的特性，更易于制浆和漂白，是两广地区首选的制浆纤维原料林造林树种。木质素含量是纸浆材遗传选育中的重要选择性状之一。早在20世纪末即有学者尝试利用基因工程技术控制木质素代谢中关键酶基因的特异性表达，开展低木质素含量桉树育种研究。肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)是尾叶桉木质素合成的关键酶之一，在木质素单体合成途径的最后一步中催化羟肉桂醛转变为对应的醇，促进木质素前体的形成。抑制CAD基因表达的转基因烟草中木质素含量显著降低，对尾叶桉CAD基因进行敲除很可能降低其木质素含量，这与纸浆材品种选育目标相一致，具有极大的研究价值。

随着分子育种技术的发展，更先进的CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单高效、靶向特异性强、可同时进行多基因编辑等优势，亦可更容易获得不含外源片段的个体，安全性更高，因此在水稻、小麦等农作物中被广泛应用，但在大多数林木树种中的研究尚停留在技术体系摸索阶段。2018年起有学者尝试将CRISPR/Cas9技术应用于桉树分子育种当中，但可能受桉树遗传转化技术尚不成熟所限，未见有应用载体转化植物后的基因编辑成功的报道。

发明内容

本发明的目的：提供一种靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的基因编辑方法。该方法针对尾叶桉CAD基因设计靶位点，利用该方法提供的靶点序列进行基因编辑，具有靶向性强的基因编辑效果。

本发明是这样实现的：

一种靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的基因编辑方法，包括以下步骤：

（1）构建含有gRNA1(SEQ ID NO. 1)和gRNA2(SEQ ID NO. 2)两个靶点序列的基因编辑载体。

（2）将含有gRNA1和gRNA2两个靶点序列的基因编辑载体转化尾叶桉原生质体，或通过农杆菌转化、基因枪等手段将基因编辑载体转化至尾叶桉植株。

（3）对转化获得的尾叶桉植物材料提取DNA进行PCR鉴定，通过电泳检测DNA切除效果。

详细的步骤可参考具体实施方式。

本发明的有益效果：

1、本发明首次公开了靶向切除尾叶桉CAD基因编码区DNA的两个靶位点，并利用靶点序列成功实现了对目标基因的靶向切除。

2、本发明建立的基因编辑方法靶向性强，可应用于桉树基因编辑育种，为进一步创制CAD敲除突变体提供研究基础。

附图说明

图1：靶位点设计示意图。

图2：pRGEB35载体结构示意图。