[发明专利]一种细胞质靶向的RNA结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种细胞质靶向的RNA结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用。本发明化合物结构式如下式1所示，可作为细胞质靶向的RNA结合蛋白富集试剂，包括如下三部分：呋喃香豆素基团，细胞质靶向基团，生物素基团；该试剂在365nm波长的紫外光照下能够与RNA中的尿嘧啶发生共价交联反应，可应用于RNA‑蛋白质复合物(RNPs)的直接标记和特异性富集；基于该试剂的RNA‑蛋白质复合物富集方法，突破了现有几类常用RNA‑蛋白质复合物富集方法的技术瓶颈，能够在维持细胞生理状态的情况下，对细胞质中RNPs的高选择性原位标记捕获；经富集后，可实现对细胞质RNA结合蛋白(RBPs)的无偏性富集鉴定或细胞质RNPs中全种类的RNA测序分析。

技术领域

本发明涉及一种细胞质靶向的RNA结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用，属于分析化学领域。

背景技术

RNA结合蛋白(RBP)在其生命周期中，在真核生物中的基因表达与调控过程扮演着关键角色。大部分的RNA能够与RBP结合形成RNA-蛋白复合物(RNP)，RBPs对于RNA的合成、选择性剪接、修饰、转运、定位和翻译等生命活动的调控都具有深远影响。因此，对RNP中RNA结合蛋白(RBP)的种类及细胞内定位进行规模化分析，对生理学和病理学研究具有重大意义。然而，由于内源性RBPs存在丰度低、共性差等特点，细胞内精确定位于细胞质中的RBPs富集鉴定使得本就难以实现的RBPs富集变的尤为艰难。

近年来，在细胞裂解液层面上，发展出了一种基于光交联的RBPs富集方法。该方法首先通过254nm波长紫外线照射使RNA-RBP交联，再利用寡聚脱氧胸苷(oligo(dT))对mRNA末端的poly(A)的配对结合抓取RNPs实现RBPs富集鉴定。该方法在一定程度上解决了RBPs富集纯化困难的问题，但仍存在只能富集RNPs中mRNA-RBP复合物的局限性，以及无法实现细胞内细胞质定位的RBPs富集鉴定的技术瓶颈。目前，基于酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)的正交有机相分离(OOPS)的方法能够解决传统(oligo(dT))无法实现的细胞内全种类RNPs的富集鉴定。但是该方法因糖蛋白的污染而存在天然缺陷，且同样由于无法实现细胞质内RBPs的特异性富集鉴定仍存在较大局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞质靶向的RNA结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用。

本发明提供了一种化合物，可作为细胞质靶向的RNA结合蛋白富集试剂(简称BNesTP试剂)，包括如下三部分：呋喃香豆素基团，细胞质靶向基团，生物素基团；该试剂在365nm波长的紫外光照下能够与RNA中的尿嘧啶发生共价交联反应，可应用于RNA-蛋白质复合物(RNPs)的直接标记和特异性富集；基于该试剂的RNA-蛋白质复合物富集方法，突破了现有几类常用RNA-蛋白质复合物富集方法的技术瓶颈，能够在维持细胞生理状态的情况下，对细胞质中RNPs的高选择性原位标记捕获；经富集后，可实现对细胞质RNA结合蛋白(RBPs)的无偏性富集鉴定或细胞质RNPs中全种类的RNA测序分析。。

本发明提供的一种化合物，其结构式如下式1所示：

本发明还提供了上述的化合物的制备方法，包括如下步骤：将式2所示化合物与

式3所示化合物进行环加成反应，即得到式1所示化合物；

上述的方法中，所述式2所示化合物与所述式3所示化合物的摩尔比可为1：1～5，具体可为1：2；

所述环加成反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、二氯甲烷或DMF，具体可为乙腈；

所述环加成反应的条件如下：温度可为4～37℃，时间可为1～48h。

所述环加成反应的具体操作为：先将式2、式3所示化合物分别溶解于乙腈溶液中，室温避光反应2～24h即可，具体可为4h。