[发明专利]超高效液相色谱串联质谱检测奶牛血液中孕酮含量的方法

说明书

本发明提供一种超高效液相色谱串联质谱检测奶牛血液中孕酮含量的方法，属于孕酮含量检测技术领域，包括以下步骤：步骤一、标准液的标定；步骤二、待测样品处理；步骤三、待测样品的检测。本发明克服了现有其检测方法灵敏度低、操作复杂和应用推广受限等缺点，本方法采用同位素内标方法，检测结果准确可靠，操作简单，检测周期短，为畜牧业生产和行业研究者提供科学依据和参考；本发明出色的分离效果、定性能力和高灵敏度，使超高效液相色谱串联质谱技术应用广泛，易于普及和推广。

技术领域

本发明涉及孕酮含量检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱检测奶牛血液中孕酮含量的方法。

背景技术

孕酮，又称黄体酮，是奶牛发情周期中黄体产生的一种激素，孕酮主要作用于子宫内膜和子宫肌，它是孕卵着床和妊娠维持所必须的激素。孕酮主要的生物学作用是调控生殖系统，参与妊娠识别和妊娠维持。随着我国经济的发展，人们生活水平不断提高，人们对肉蛋奶的需求量也大幅度增加，奶牛养殖业是我国畜牧养殖业中的支柱产业，在奶牛养殖业中，繁殖效率是决定牛群经济效益的关键因素之一。检测奶牛孕酮水平不仅可以了解母畜的生殖生理规律，还可以检测母畜生殖系统疾病，孕酮的检测对于牧场区分奶牛妊娠状态、缩短产犊间隔、减少输精次数具有重要意义。在国外，监测孕酮含量，以提高牛群繁殖效率，保障养殖的经济效益，已被当做一种重要的管理措施在生产中广泛应用。

目前，孕酮的检测方法主要有放射免疫法、胶体金法和酶联免疫法等。但是这些方法存在灵敏度低、操作复杂和应用推广受限等缺点，目前血液中孕酮检测方法没有国家标准，有关液质联用仪研究报道也相对较少。

因此，需要提供一种超高效液相色谱串联质谱检测奶牛血液中孕酮含量的方法，以解决上述现有存在的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种超高效液相色谱串联质谱检测奶牛血液中孕酮含量的方法，克服了现有其检测方法灵敏度低、操作复杂和应用推广受限等缺点，本方法采用同位素内标方法，检测结果准确可靠，操作简单，检测周期短，为畜牧业生产和行业研究者提供科学依据和参考。

为解决上述技术问题，本发明提供一种超高效液相色谱串联质谱检测奶牛血液中孕酮含量的方法，包括以下步骤：

步骤一、标准液的标定

1.1标准工作液和内标工作液的配制：

精确量取浓度1000 ng/mL孕酮标准工作溶液和浓度1000 ng/mL氘代孕酮内标工作液备用，用流动相稀释，配置成孕酮浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL，氘代孕酮浓度为10 ng/mL的内标工作液，供液质联用仪测定；

1.2标准曲线的制备：

用高效液相色谱串联质谱仪分别对上述标准溶液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的孕酮色谱图和其对应的氘代孕酮色谱图，以上述至少三个标准溶液的孕酮标准工作溶液酮峰面积和其对应的氘代孕酮内标工作液中氘代孕酮峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述孕酮标准工作溶液中含有孕酮的浓度与氘代孕酮内标工作液中氘代孕酮浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

步骤二、待测样品处理

全血以4000 r/min转速离心2 min，取血清400μL，加入0.5%的甲酸水溶液100μL和20 μL 50 ng/mL 孕酮内标，混合均匀；将固相萃取柱安装在固相萃取装置上，依次用1mL0.5%甲酸甲醇溶液和1mL 0.1mol/L 0.5%甲酸水溶液溶液过柱，取经处理的血清样品过柱，用1 mL 30%甲醇水溶液淋洗，吹干固相萃取柱，最后用0.5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在40℃下用氮气吹干，用初始流动相0.1mL复溶，得到待测样品液，供超高效液相色谱串联质谱测定；

步骤三、待测样品的检测