[发明专利]一种肝素结合蛋白抗体及其试剂盒、应用

说明书

本发明涉及一对配对使用的能够特异性结合人肝素结合蛋白的单克隆抗体，以及由该单克隆抗体制备的人肝素结合蛋白检测试剂盒，以及该单克隆抗体在检测人肝素结合蛋白中的应用。该单克隆抗体配对检测人肝素结合蛋白具有灵敏度高、线性范围宽、不同方法学检测平台抗体可以通用的优势。

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体地说是涉及一对配对使用的能够特异性结合人肝素结合蛋白的单克隆抗体，以及由该单克隆抗体制备的人肝素结合蛋白检测试剂盒，以及该单克隆抗体在检测人肝素结合蛋白中的应用。

背景技术

肝素结合蛋白(Heparin-Binding Protein，简称HBP)，是一种由成熟中性粒细胞分泌的蛋白质，由Shafer等在1984年发现并分离成功。该蛋白具有杀菌活性，带有正电荷，由于当时测得相对分子质量为373000，因此将其命名为CAP37。后来不久，Gabay等后来学者又从嗜苯胺蓝颗粒中分离出具有杀菌活性的嗜苯胺蓝蛋白，命名为Azurocidin，即天青杀素。1991年Flodgaard等分别从人和猪的多形核白细胞颗粒中分离出具有极强肝素结合能力的蛋白，并将其命名为heparin-binding protein(HBP，肝素结合蛋白)。随着研究的进行，通过蛋白及相关基因测序证实，CAP37、Azurocidin、HBP是同一种蛋白；而且进一步的研究也证实了HBP是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族的一员。

HBP是从251个氨基酸的前体中，在N末端切除26个氨基酸残基、C末端切除3个氨基酸残基而合成的一个单链糖蛋白。成熟的HBP由上述剩余的222个氨基酸残基构成，相对分子质量为24000。序列分析表明其与人的中性粒细胞弹性蛋白酶有45％的同源性，与蛋白酶3有42％的同源性，与人的嗜中性粒细胞中的组织蛋白酶G有32％的同源性。

HBP主要是由PMN受外界刺激所释放，所以正常人血中HBP含量很低，一般不超过10ng/ml，当有感染发生时，部分细菌侵入到血管内，菌体本身或者细菌释放的毒素等物质刺激中性粒细包释放HBP，从而导致血中HBP含量升高，HBP在一般感染时能达到20-30ng/ml，ICU中严重感染会更高，可能超过100ng/ml。出现细菌感染循环中最早升高的标志物之一，局部或轻微的细菌感染也会导致HBP迅速升高；细菌感染HBP水平升高，非细菌感染HBP水平不升高；半衰期短，可迅速反应患者病情好转或恶化以及抗生素治疗效果，并评估是否需要更换抗生素或停药。

目前，临床上将HBP≥15ng/mL作为严重败血症的标志，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别可以达到87.1％、95.1％、88.4％以及94.5％；在以上指标中，IL-6水平、乳铁蛋白水平、CRP水平、白细胞数量、降钙素原水平等指标可能在某一项表现突出，但其他项却很低，甚至低至30％左右。综合对比，HBP是比IL6、CRP、PCT更加优秀的感染标志物。

比较早期的HBP检测产品采用的是ELISA法，例如英国Axis-Shield公司的酶联免疫分析试剂，检测范围5.9-200ng/ml。由于其方法学落后、HBP抗体性能平庸，导致其存在耗时太长，高值样品容易产生Hook效应，检测灵敏度和线性范围有限等缺陷。免疫层析法可以实现即时快速检测，公开号为CN111562363的专利申请提到了一种层析法HBP检测，但是它不能起到定量检测的作用，灵敏度、准确性也很低；公开号为CN105572386的专利申请提到的免疫荧光层析法使用Abnova的HBP多克隆抗体和单克隆抗体，其线性范围达到了1-200ng/ml，但是上限仍然不够高；公开号为CN108267592的专利申请提到的免疫微球试纸，使用的是HBP多克隆抗体和单克隆抗体，但并没有提到其检测灵敏度和线性范围。公开号为CN110806487的专利申请提到的基于胶乳微球的免疫比浊法检测HBP，可以达到较好的灵敏度和线性范围，但是其主要技术特点是混合使用了大、小两种粒径和不同电荷的微球，拉宽了检测的线性范围，其技术进步并非因为HBP抗体原料的性能进步所致。