[发明专利]一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法

说明书

本发明属于基础研究技术领域，公开了一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括：准备相关病毒的载体；进行目的基因和指示基因的克隆；进行VIGS重组载体的构建；进行病毒诱导的基因沉默的实验。本发明的病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，利用烟草脆裂病毒(TRV，Tobravirus)介导进行藜麦基因功能验证，涉及利用TRV(Tobravirus，烟草脆裂病毒)病毒载体，以藜麦PDS(phytoene desaturase，八氢番茄红素脱氢酶)基因为标记基因，在藜麦中通过TRV病毒介导的VIGS体系进行基因的功能分析方法。

技术领域

本发明属于基础研究技术领域，尤其涉及一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法。

背景技术

目前，藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)属于苋科藜属一年生植物，籽粒具有极高的营养价值，其蛋白质含量远超其他粮食，富含多种人体必需氨基酸、且含量均衡，藜麦中还含有丰富的矿物质、不饱和脂肪酸、黄酮、多酚、皂苷等活性物质，具有抗氧化、降血脂、增强免疫等生理功效，进而能够降低患一些疾病的风险等生理功能。此外，籽粒不含麸质，特别适合对麸质过敏的人群，具有增强其免疫力的作用。

近年来，随着人们对健康需求的提高，对藜麦产量的需求也大量增加。由于藜麦花序呈圆锥型，具有多级分枝，花序(穗)大而紧密，藜麦的花小，藜麦的花由不同大小的雌花及两性花组成，比例受到遗传和环境的影响。两性花有4～8个花药与萼片对生，1个上位子房，子房上柱头有2或3个分枝，主要分布于主花枝和次级花枝的顶端；雌花有三种类型，按花被的存在与缺失分为具花被的大雌花、具花被的小雌花和无花被的小雌花。

由于藜麦花的结构和着生部位的差异，且花结构的复杂性，导致人工去雄难，致使藜麦杂交技术研究进展缓慢。在自然界中，藜麦常存在花粉败育的现象，严重时出现整朵花的花药完全败育，常常导致藜麦籽粒出现空瘪粒的现象，产量受到较大影响。因此，亟需一种新的藜麦基因功能的验证方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：由于藜麦花的结构和着生部位的差异，且花结构的复杂性，导致人工去雄难，致使藜麦杂交技术研究进展缓慢。在自然界中，藜麦常存在花粉败育的现象，严重时出现整朵花的花药完全败育，常常导致藜麦籽粒出现空瘪粒的现象，产量受到较大影响。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，尤其涉及一种通过病毒介导的基因沉默(virus-induced genesilencing，VIGS)进行藜麦基因功能验证的方法。

本发明是这样实现的，一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括以下步骤：

步骤一，准备相关病毒的载体；

步骤二，进行目的基因和指示基因的克隆；

步骤三，进行VIGS的重组载体的构建；

步骤四，进行病毒诱导的基因沉默的实验。

进一步，步骤三中，所述VIGS的重组载体的构建，包括：

指示基因，即PDS基因和目的基因扩增片段与病毒载体的连接，采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为指示基因-病毒连接的重组载体和病毒-目的基因连接的重组载体。

进一步，所述PDS基因和AMS基因的克隆，包括：