[发明专利]特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核酸适配体及其用途

说明书

本发明提供一条与布鲁氏菌外膜蛋白Omp31具有高亲和力的核酸适配体，该适配体的核苷酸序列如序列表中序列1所示，全长76bp，两端20bp为固定序列，中间36bp由筛选后确定出唯一确定序列。本发明利用SELEX技术，以原核表达的Omp31为靶标蛋白，以羧基磁珠为固相载体，通过9轮筛选及高通量测序，从10supgt;15/supgt;初始DNA文库中，筛选得出本条与靶标具有高亲和力的核酸适配体。核酸适配体相对于抗体，具有易合成保存、成本低廉等优点，为开发新型夹心ELISA检测试剂盒提供了新的思路，对布鲁氏菌的检测和预防具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核 酸适配体及其用途。

背景技术

布鲁氏菌是胞内寄生的革兰氏阴性球状杆菌，在常温下存活时间可达数月之久，布鲁氏菌具有明显的宿主特异性，同时具有交叉感染的能力，可通过家畜、宠物种布鲁氏菌感染人类，这种由布鲁氏菌引起的人畜共患病被称为布鲁氏菌病，简称布病，是目前世界上流行最广的人畜共患传染病之一，变种较多，感染范围极广。

布鲁氏菌的外膜中有脂多糖、磷脂和蛋白质。布鲁氏菌外膜蛋白位于细菌细 胞膜的最外层，因其具有免疫原性和免疫保护作用一直备受注目。Omp31是布鲁 氏菌的外膜蛋白中极为重要的免疫保护性抗原，也被认为是一种孔道蛋白，具有 高度保守性，在维持细菌外膜结构稳定性中发挥着重要的作用。已有研究证明 Omp31与布鲁氏菌的毒力相关。

布鲁菌病临床症状复杂，引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混 淆；医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布鲁杆菌感染，给诊断带来了一定的困 难，容易导致误诊，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段，抗生素的大 量长期使用仍很难见效，且容易引起耐药性问题。因此，布鲁杆菌的疫苗预防和 早期快速诊断对布菌的防控具有重大的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊 断的准确性就显得尤为重要。

适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸 分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适 配体的获得是通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)的体外筛选过程。核 酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代 动力学特性、无免疫原性、经济等特点。指数富集的配体系统进化技术，是一种 成熟而有效的制备高靶亲和力寡核苷酸的技术。这些SELEX衍生的短的、单链脱 氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)被称为适体(Aptamer)，是针对蛋白质、 细胞、微生物、化合物等多种靶点进行筛选的。它们作为新型抗体，在癌症治疗 学和生物医学研究中具有巨大的潜力。对适体的巨大兴趣刺激了SELEX的不断发 展，自1990年首次应用以来，SELEX经历了多次修改。新的修改使选择过程更高 效、更具成本效益，并且大大减少了耗时。经过数十年的发展，现已可通过SELEX 获得高特异性适体，例如低纳摩尔Kd，多重靶向或核酸酶抗性。这些新获得的功 能对适体在研究，诊断和治疗各个领域的应用产生了巨大影响。生物膜干扰技术 (BLI)原理是一束可见光穿过光纤，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形 成两束反射光谱，叠加形成一束干涉光谱，分子结合导致膜层厚度变化，并通过 干涉光谱的位移值而体现，具有无标记、实时监测、浸入即读的三大特点。

生化培养虽然是布鲁菌病检测的金标准，但是该方法存在耗时长，生物安全 等方面诸多局限性，因此用特异性高的血清学检查仍然是主要采用的血清学方法， 如我国主要通过RBPT和SAT相结合的方法进行布鲁菌病的初筛和诊断，评判治 疗效果。但是这两种检测方法都存在一些问题，一是不能区分自然感染和疫苗免 疫接种产生抗体的难题，严重影响了布鲁菌病的检测和疫苗免疫预防策略。二是 RBPT法假阳性率较高，SAT法操作较为繁琐，耗费时间长，容易出现假阴性结果。 M5-90是减毒羊种布鲁杆菌疫苗株，Omp31蛋白为膜孔蛋白，与该弱毒菌苗株毒 力相关，并含有保护性抗原表位，其基因序列在不同的种属之间的同源性高达98％ 以上。因此，利用针对Omp31蛋白的单克隆抗体，可建立布鲁杆菌病原体及布鲁 菌病诊断方法及其诊断试剂，进而解决布鲁菌病鉴别诊断、预防、治疗和预后判断等方面的技术难题。