[发明专利]一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用

说明书

本发明公开了一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的解聚酶Depo58及应用，该噬菌体解聚酶Depo58的制备包括如下步骤：S1.通过PCR及基因片段纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a‑depo58质粒；S2.将pET28a‑depo58质粒转化到大肠杆菌BL21。基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用：通过对肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框（orf58），进行原核表达和纯化而获得了噬菌体解聚酶Depo58，该解聚酶能够清除KL2型肺炎克雷伯菌所形成的荚膜多糖，并且具有对生物被膜的形成具有高效的抑制作用的潜力，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种常见的人畜共患病原菌，近年来，多重耐药肺炎克雷伯菌已成为医源性感染的最主要病原体之一，该细菌不但对人类公共卫生事业造成了巨大威胁，而且在一定程度影响了动物养殖业的健康发展。

大多数肺炎克雷伯菌具有合成和分泌荚膜多糖的能力，荚膜多糖作为细菌的天然屏障可维持细菌毒力、粘附、阻断一些抗生素渗透，作为肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，荚膜多糖对公众健康构成巨大威胁，此外，一些肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植，因此，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验。

噬菌体解聚酶（depolymerase）通过降解细菌表面多糖，进而引导噬菌体吸附于宿主外膜蛋白。该酶通过随机攻击糖苷键以释放聚合物的重复单元，实现靶向降解荚膜多糖，诸多国内外研究表明，噬菌体解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共卫生领域具备一定的应用潜力。但是，不同来源、不同核酸序列以及不同蛋白结构的噬菌体解聚酶，对不同类型的荚膜多糖和生物被膜所表现的降解性能也是有非常大的差别。

例如，文献：“Biological properties and genomics analysis of vB_KpnS_GH-K3, a Klebsiella phage with a putative depolymerase-like protein，Virus Genes(2019) 55:696–706”公开了一种噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对K2型起作用，对KL2型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用，以解决上述背景技术中提出的肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验，同时噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对KL2型起作用，对其他K型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用，该噬菌体解聚酶Depo58的制备与对肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解包括如下步骤：

S1.通过PCR方法获得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a-depo58质粒；