[发明专利]一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称“蓝耳病”，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)感染导致的猪病毒性传染病，给各国养猪业造成重大经济损失。据统计，PRRS每年给美国造成的经济损失约6.5亿美元。基于我国的养殖规模以及该病在我国的流行情况，该病每年给我国造成的经济损失远远超过这个数字。PRRS的主要临床症状以各生长阶段呼吸道疾病以及母猪繁殖障碍为特征，常表现为发热、厌食、呼吸困难等，还会导致严重的免疫抑制。PRRS于1995年首次在我国上海、北京爆发，随后向其周围地区和省份蔓延。随着这些年来猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速演化，我国临床上的主要流行毒株包括经典毒株、高致病性毒株(HP-PRRSV)、类NADC30毒株和类NADC34毒株等。商品化的疫苗能够提供良好的同源保护，但是对异源毒株保护非常有限。不断出现的新毒株大大降低了商品化疫苗的保护效果，这已成为PRRS防控急需克服的困难。

反向遗传操作系统是一种定向改造和修饰病毒基因组的重要基因工程技术，该技术已成为病毒学基础研究和疫苗研发必不可少的技术平台。迄今，各国科学家已经成功构建了PRRSV的反向遗传操作系统，并将其用于解析PRRSV的复制机制、致病机制以及病毒宿主相互作用机制。PRRSV感染性cDNA克隆也被用作病毒载体表达外源基因。据报道，PRRSV基因组中多个区域可用于表达外源基因，包括nsp2的高度变异区、nsp12/GP2a之间、ORF4/ORF5a之间和 ORF7/3’UTR之间等位置。以PRRSV为载体，成功表达了多种报告基因，包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶等。与上述报告基因相比，gaussia luciferase(Gluc)作为一种分泌性荧光素酶，细胞中合成的80％以上荧光素酶均能分泌至细胞外，细胞上清中的荧光素酶活性可以反应Gluc的表达情况。并且，Gluc反应产生的荧光强度是萤火虫和海肾荧光素酶的 100倍以上。本发明建立猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且将 PRRSV TRS6和Gluc基因组成的表达框插入到ORF7和3’UTR之间，构建了表达Gluc的标记病毒，将该病毒应用于抗病毒药物的快速评价。本发明为深入解析HP-PRRSV的致病机制和特异性抗病毒药物筛选奠定了基础。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆；

本发明还要解决的技术问题是提供上述表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA克隆的构建方法；

本发明最后要解决的技术问题是提供上述表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA克隆的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆构建方法，包括以下步骤：

(1)本发明优选的载体为pACYC177低拷贝载体，将人工合成的SEQ ID NO:1插入pACYC177质粒，得到重组质粒pCMV-TA-vector；