[发明专利]一种干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法

说明书

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法。本发明通过调节Wnt、TGF‑β和FGF信号通路，将人多能干细胞定向诱导分化为肾脏祖细胞，之后将祖细胞制备成单细胞悬液，通过其自组装形成肾脏类器官。本发明提供的干细胞诱导分化的方法，能高效、稳定的建立肾脏类器官，可以为研究肾脏疾病、进行肾脏毒性评估提供强大平台。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法。

背景技术

肾脏是重要的人体器官，具有排除体内代谢废物，调节电解质平衡，分泌肾素、促红细胞生成素等生理功能。研究表明，成人的肾脏一天能过滤大概200L的液体。然而，肾脏组织在出生之后，其再生功能逐渐丧失。衰老、疾病、环境等因素对肾脏造成不可逆的损伤，肾脏功能逐渐受损，从而导致肾脏疾病。随着疾病不断发展，最终导致终末期肾病，需要进行透析或者肾移植。有研究表明，全球约有10％的人口患有肾脏疾病。肾脏疾病严重危害公共健康，对经济社会发展造成巨大损失。

干细胞是一种具有自我复制和更新能力的细胞，并且可以在体外定向诱导分化形成各种机体细胞，从而建立相应的类器官。近年来，利用干细胞诱导分化建立的类器官为研究器官疾病致病机制、探索器官移植的来源提供了新的技术与方法。美国哈佛医学院的团队建立了干细胞诱导分化为肾脏类器官的方法，并且申请了相关专利。然而该方法存在分化不稳定、分化效率低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法。

根据本发明具体实施方式的干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法,所述方法包括以下步骤：

(1)将人诱导多能干细胞制备成单细胞悬液；

(2)向步骤(1)所得的单细胞悬液中加入10μM Rock inhibitor，按照1.5×10⁴/cm²的细胞密度接种细胞，进行培养；

(3)待步骤(2)培养的细胞长到50％密度时，加入分化培养液、wnt信号通路激活剂和TGF-β信号通路抑制剂，计为分化第0天，每天换液；

(4)分化第4天，使用分化培养液继续培养72小时，每天换液；

(5)分化第7天，在分化培养液中加入FGF9，培养48小时，每天换液；

(6)分化第9天，在分化培养液中加入FGF9和wnt信号通路激活剂；

(7)分化到第11天，将细胞换至含有FGF9的分化培养液中，继续培养，每天换液；如不进行3D肾脏类器官的建立，将分化细胞维持在含有FGF9的分化培养液中进行培养，直至分化结束；

如要进行3D肾脏类器官的建立，在分化第11天-第14天，将培养的细胞消化制备成单细胞悬液后，在含有Rock inhibitor和FGF9的分化培养液中进行培养，第二天换至含有FGF9的分化培养中进行培养，直至分化结束。

根据本发明具体实施方式的干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法,在分化培养液中加入1～20μM wnt信号通路激活剂和0.1～2μM TGF-β信号通路抑制剂。

目前市售的Wnt信号通路的激活剂有：CHIR-99021、KY19382、CP21R7(CP21)、CGP57380等，本发明优选CHIR-99021作为Wnt信号通路的激活剂。

目前市售的TGF-β信号通路抑制剂：A-83-01、LDN-193189、SD-208、GW788388、SRI-011381、LY2109761、SB431542等，本发明优选SB431542作为TGF-β信号通路抑制剂。

根据本发明具体实施方式的干细胞诱导分化建立肾脏类器官的方法,分化第7天，在分化培养液中加入40～80ng/mL FGF9。