[发明专利]一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗，其特征在于，所述注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗中包括灭活的大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202070，分类命名为大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心；

所述灭活疫苗还包括佐剂，所述佐剂为IMS1312；

所述灭活疫苗中包含10⁸ TCID₅₀ /ml的灭活大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907。

2.一种制备权利要求1所述的注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，EPC细胞的培养；

步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的增殖；

步骤三，病毒的收获；

步骤四，病毒滴度的测定；

步骤五，灭活处理；

步骤六，疫苗的制备：将灭活好的疫苗原液与佐剂混合后制备得到灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，EPC细胞的培养：将EPC细胞于含10％（V/V）胎牛血清的M199培养基中进行传代培养，25℃，5% CO₂恒温培养至细胞汇合，长成单层，细胞数量10⁶/mL；

步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907的增殖：吸出EPC细胞中的培养液，然后按1/10的培养基体积加入滴度为10⁵TCID₅₀/mL 的N-LBIV-201907的病毒悬液，在病毒吸附细胞1h后，补加pH7.2～7.5、含2％(V/V) 小牛血清的M199维持液进行病毒增殖；

步骤三，病毒的收获：病毒连续培养4～7天，在显微镜下观察，待80% EPC细胞出现典型细胞病变效应时，置于-80℃冰箱冻存，冻结后取出置于37℃水浴加热溶解，如此反复冻融两次，将病毒感染的细胞悬液装入50ml无菌离心管里，在 4℃以 4400 g 离心 20 min，去除细胞碎片，收集离心后上清液，即获得扩增病毒原液，-80℃保存备用，用于后续滴度实验以及灭活疫苗制备；

步骤四，病毒滴度的测定：将大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907疫苗毒株进行传代扩增，收集病变细胞和病毒裂解液后，进行TCID₅₀测定，经测定，病毒接种细胞后第5天的TCID₅₀可达到10^10.55/ml以上，得到高滴度的病毒液；

步骤五，灭活处理：取保存于-80℃的高滴度的病毒液于室温融化，加入福尔马林溶液使其终浓度为0.2％ (V/V)，混合均匀后置于37℃条件下灭活48-72h，灭活结束后，添加终浓度为0.05％的亚硫酸钠中和残余福尔马林，即获得大口黑鲈虹彩病毒N-LBIV-201907灭活疫苗原液，并置于4℃冰箱保存备用；

步骤六，疫苗的制备：将灭活好的疫苗原液用0.65％鱼用生理盐水稀释至效价为2×10⁸TCID₅₀ /ml，加入1:1的佐剂IMS1312混匀，即得到注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗。