[发明专利]一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，所述罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法包括以下步骤：

步骤一，进行细胞培养基的配置：取M199培养基粉末，利用无菌去离子水溶解后，分别进行抽滤和分装；取少量培养液进行无菌测试后，置于4℃条件下保存，得基础细胞培养基；向基础培养基内依次加入胎牛血清、维生素C、碳酸氢钠、表皮生长因子和双抗，混合均匀，进行pH的调节和灭菌处理，即可制得完全细胞培养基，备用；

所述灭菌处理包括：通过具有0.2μm直径微孔的滤膜进行过滤灭菌；

步骤二，进行罗非鱼腹鳍细胞块的预处理：取健康已被处死的罗非鱼，量体长，称重，浸入75％的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；剪取罗非鱼腹鳍组织，于青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡，消毒，冲洗，于无菌条件下将罗非鱼腹鳍细胞块剪成0.5～1.5mm³的组织块；将组织块浸泡在0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA中消化10～25min后，再用0.5％的透明质酸酶消化0.5～2.5h，即得预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块，备用；

所述青霉素-链霉素双抗溶液制备方法包括：将青霉素、链霉素与一定量的三蒸水混合即可得所述青霉素-链霉素双抗溶液；

步骤三，进行罗非鱼腹鳍细胞的原代培养：将预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块移植到装有基础细胞培养基的25cm²细胞培养瓶中，保持26℃培养；去除基础细胞培养基，加入2mL胰酶进行消化处理，终止消化反应，过滤消化产物，离心，重悬细胞沉淀；移植至另一25cm²细胞培养瓶中，补充完全细胞培养基，置于28℃细胞培养箱中静置培养，每天半量更换培养基一次；

步骤四，进行罗非鱼腹鳍细胞的传代培养：待原代培养细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶进行静置消化；于显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜完全细胞培养基制备细胞悬液，按照1:3的比例接种至两个25cm²细胞培养瓶中在28℃培养箱中进行静置传代培养，传代培养50代即得罗非鱼腹鳍细胞系。

2.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述胎牛血清占细胞培养基总体积的10～20％，所述维生素C的浓度为1～50μg/ml，所述碳酸氢钠的浓度为1～100μg/L，所述表皮生长因子的浓度为5～100ng/ml。

3.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述双抗包括青霉素150～200U/mL，链霉素0.05～0.2mg/mL。

4.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述完全细胞培养基的pH为7.5～8。

5.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述浸泡，消毒，冲洗，包括：

将罗非鱼腹鳍组织于浓度为1000IU/mL青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30～45min，以75％的酒精进行消毒处理，用浓度为2.5ug/mL的两性霉素B的D-PBS冲洗3～5次。

6.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述消化处理的时间为15～30min。

7.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述离心的方法为：于1000～1500rpm的条件下离心10～15min。

8.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述补充完全细胞培养基，包括：

于移植后的第15h加入2～5mL的完全细胞培养基，于第24h加入3～6mL的完全细胞培养基。

9.一种应用如权利要求1～8任意一项所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法构建得到的罗非鱼腹鳍细胞系。

10.一种如权利要求9所述的罗非鱼腹鳍细胞系在细胞工程、基因工程或生物医学工程中的应用。