[发明专利]条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法和应用，属于基因工程抗体技术领域，制备条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体时分别选取条纹斑竹鲨IgNAR可变区的氨基酸序列及IgNAR恒定区的氨基酸序列合成多肽，作为抗原，并经过动物免疫后制备得到多克隆抗体Anti‑vNAR和Anti‑cNAR；本发明制得的条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体为今后鲨鱼抗体的开发、利用及相关的研究提供有力的支持。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术

抗体是指机体在抗原性物质的刺激下所产生的免疫球蛋白，其能够与相应抗原发生特异性结合。对于一般抗体而言，其结合抗原表位的部位由抗体的重链可变区(variabledomain of heavy chain，VH)和轻链可变区(variable domain of light chain，VL)共同构成，但二者对于抗原结合的贡献是不同的，一般情况下，重链可变区发挥主要作用，单独的重链可变区仍具有抗原结合能力，但是轻链可变区的缺乏将使重链可变区对抗原的亲和力降低，并且易于积聚和沉淀。传统抗体来源主要包括鼠、兔和人等。1989年，Ward等(Nature 1989，341：544-546)首次制备了仅由抗体的VH区构成的基因工程抗体，因为仅由一个结构域组成，故称之为单域抗体(single domain antibody)。之后，通过克隆一般抗体的可变区而构建的单域抗体在亲和力和稳定性等方面有了很大提高。

驼科动物和软骨鱼类等血清中不但存在常规的IgG抗体，同时还存在一种天然缺失轻链，仅有重链的IgG抗体，该类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区的单一结构域组成，被命名为重链抗体(VHH)或单域抗体，VHH同普通IgG抗体分子一样保持了良好的、特异的抗原结合能力，是目前已知的具有完整抗体功能的最小分子片段，分子量仅为15kD，称为纳米抗体。重链抗体具有更长的抗原互补结合区，因此组织穿透性能力强，可以作用到一些普通抗体分子无法接触的抗原部位，发挥抗体的功能。鲨鱼的重链抗体被称为IgNAR，由1个可变结构域(vNAR)与5个恒定结构域(cNAR)组成，将可变结构域重组表达，即可获得具有完整功能的抗体分子片段，为鲨鱼的单域抗体。与传统的抗体相比，鲨鱼单域抗体具有组织渗透性好、稳定性高、制备成本低廉和生产周期短等独特优势。

目前，关于鲨鱼单域抗体的研究基本上是集中在单域抗体的应用、表达和检测，例如分子探针的开发、疾病诊断试剂盒以及治疗药物的研制。然而，由于市场上缺乏鲨鱼单域抗体的二抗，这就导致对鲨鱼单域抗体的制备、研究和应用都造成了限制，主要体现在：其一，目前单域抗体的筛选和制备主要通过免疫法，即以抗原对动物进行多次免疫，再建立免疫抗体库进行靶向筛选，在此过程中，抗体血清效价是检测免疫应答，以及确定抗体库时机的重要指标，但是，由于缺乏特异的二抗，目前尚无方法对免疫过程中的抗体血清效价进行有效的监测；其二，目前鲨鱼单域抗体通常携带标签蛋白，如His、Flag、GST或HA等，再以标签抗体为二抗进行检测，但是，该方法的使用可能导致鲨鱼单域抗体失去其独特的优势；例如，由于动物组织的蛋白组中具有相当部分的蛋白质中存在多个His串联的情况，使用His标签抗体会产生非特异性结合，因此，带有His标签蛋白的单域抗体就不宜用于免疫检测中；此外，由于GST、MBP等标签蛋白分子量较大，这些标签蛋白的使用不仅使得单域抗体失去其“小”的优势，同时很可能导致其抗体功能及活性发生改变。

因此，亟需开发一种针对于鲨鱼单域抗体的多克隆抗体，以期为今后鲨鱼单域抗体的开发、利用及相关的研究提供有力的支持。

发明内容

为了提供针对于与鲨鱼单域抗体的多克隆抗体，以支持单域抗体的开发、利用及研究，本申请创造性地提出条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用，以克服由于鲨鱼单域抗体的二抗的缺少导致的制备和应用的限制。

本发明的技术方案如下：