[发明专利]一种流感疫苗TPCK-胰酶残量检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测流感疫苗中TPCK-胰酶残量的检测试剂，所述的检测试剂为多克隆抗体，其特征在于，

所述的流感疫苗为采用MDCK细胞基质生产的流感疫苗，

所述的多克隆抗体的制备方法为：由TPCK胰酶免疫家兔后获取抗血清，再经ProteinA/G亲和层析法纯化。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，

(1)所述的TPCK胰酶为采用MDCK细胞基质生产流感疫苗时使用的胰酶；

(2)所述的免疫家兔后获取的抗血清的步骤为：

初次免疫使用300μg TPCK-胰酶并按体积1：1加入弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点免疫；

然后每间隔1周，使用400μg TPCK-胰酶，并按体积1：1加入弗氏不完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点免疫，免疫4次；

最后一次免疫后10天颈动脉采血，将获取的兔全血在37℃环境放置2h后，25℃2500rpm离心15min，吸取上层血清；

(3)所述的Protein A/G亲和层析法的步骤为：

血清效价最高的抗血清(效价为64000)，滤纸过滤去除脂质；

使用结合/洗涤缓冲液(0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH 8.0)对血清进行1：1稀释；

用5倍体积的结合/洗涤缓冲液平衡Protein A/G亲和层，缓慢流速将稀释后血清注入柱内，待柱内液体完全流出；

使用15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗脱非特异性吸附的干扰抗体，待柱内液体完全流出；

用5倍体积的洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸pH2.5～3.0)洗脱抗体，收集流出液，即目的抗体组分。

3.使用权利要求1或2所述的检测试剂制备的ELISA双抗夹心检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(1)捕获抗体：前述方法制备获得的多克隆抗体；

(2)标记抗体：用过碘酸钠法对前述方法制备的多克隆抗体进行HRP标记，制备得到的HRP-TPCK-胰酶抗体；

(3)必要的对照品和试剂。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，

所述捕获抗体的包被量为8μg/mL‘

所述标记抗体的稀释度为1：800。

5.根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂包括：

封闭液：含有5％BSA的10mM pH 7.2的PBS；

洗涤液：含有0.01％Tween-20的10mM pH 7.2的PBS；

稀释液：含有1％BSA的洗涤液；

终止液：2M H2SO4。

6.使用所述的权利要求1-5任一所述的检测试剂或检测试剂盒在检测流感疫苗中TPCK-胰酶残量中的应用，所述的流感疫苗为采用MDCK细胞基质生产的流感疫苗。

7.使用权利要求4或5所述的检测试剂盒检测流感疫苗中TPCK-胰酶残量的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)使用pH 9.6的包被液将TPCK-胰酶抗体稀释为8μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)洗板2～4次后加入封闭液，每孔200μL，37℃反应1h；

(3)洗板2～4次后加入待试品，每孔100μL，37℃反应1h；

(5)洗板2～4次后加入显色液，每孔50μL，室温避光反应10～30min；

(6)加入终止液，每孔50μL，轻微振荡混匀，使用酶标仪测定OD450值；

(7)将测得待试品的OD450值代入标准曲线方程计算出TPCK-胰酶浓度；

所述的流感疫苗为采用MDCK细胞基质生产的流感疫苗。