[发明专利]一种包载靶标lncRNA Pvt1纳米粒子的水凝胶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种包载靶标lncRNA Pvt1纳米粒子的水凝胶及其制备方法和应用。制备方法包括：含有编码Pvt1短发卡RNA的质粒(shPvt1)构建；鼠源结直肠癌CT26细胞膜CM的制备；脂质体(D)修饰细胞膜包载shPvt1纳米粒子(shPvt1‑CM‑D)的制备；制备氧化海藻酸盐(OA)；制备己二酸二酰肼修饰的透明质酸HA‑ADH。通过移植于结直肠癌(CRC)术后原位，该水凝胶持续性释放shPvt1‑CM‑D和化疗药物奥沙利铂(Oxa)并介导三重免疫响应：联合增强的肿瘤免疫原性细胞死亡(ICD)；双重效应的肿瘤疫苗；弱化粒细胞‑髓源抑制细胞(G‑MDSC)的免疫抑制活性，最终重塑肿瘤环境以达到抑制CRC术后复发和转移的目的。

技术领域

本发明涉及生物医用复合材料技术领域，特别涉及一种包载靶标lncRNA Pvt1纳米粒子的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

结直肠癌(CRC)是世界第四大癌症杀手，外科手术依然是CRC的主流疗法，但术后残余的微肿瘤块和循环肿瘤细胞易导致复发和转移，其死亡占比高达90％。传统的化疗和放疗面临诸如强烈的并发症和毒副作用等问题。尽管新兴的免疫治疗有望抑制CRC的复发和转移，但免疫响应率低。因此，亟待发展安全且高效的术后疗法抑制CRC的复发和转移。

长非编码RNAs(lncRNAs)具有200个以上的核苷酸且在调控基因表达中发挥关键作用。lncRNA浆细胞瘤变异易位基因1(Pvt1)的敲减能有效抑制肿瘤的发生发展，敏化化疗和弱化粒细胞髓源抑制细胞(G-MDSCs)的免疫抑制活性。授权公告号CN107043823B的专利公开了一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第17号染色体chr17:47785696-47797422。根据lncRNA-KAT7序列，设计并合成特异性实时荧光定量PCR引物，制备用于结直肠癌诊断或者疗效预测的制剂。利用实时荧光定量PCR制剂，在结直肠癌临床病例标本中检测lncRNA-KAT7的表达水平，发现lncRNA-KAT7可作为结直肠癌的肿瘤标志物，可制备用于结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的制剂或试剂盒。然而，单一lncRNA的调控对重塑肿瘤微环境(TME)的影响易受TME中复杂基因调控网络的制约，不能有效抑制CRC术后复发、肝转移和远端瘤生长，急需提高靶标lncRNA重塑TME的疗效。不仅如此，目前有关lncRNA的报道主要集中于机制研究，而基于lncRNA调控的治疗策略少有报道。

融合纳米技术的支架能时空缓释负载的药物分子，并提高其生物稳定性、生物分布和胞内摄取能力。不仅如此，肿瘤细胞膜能用于仿生纳米粒子的制备，其包含的全系列同源肿瘤相关抗原(TAAs)有助于树突细胞(DC)的成熟和后续免疫响应的激活。因此，亟待基于此思路设计一种治疗结直肠癌的生物医用复合材料。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种包载靶标lncRNA Pvt1纳米粒子的水凝胶及其制备方法和应用，以解决现有技术中单一lncRNA的调控对重塑肿瘤微环境(TME)的影响易受TME中复杂基因调控网络的制约，不能有效抑制CRC术后复发、肝转移和远端瘤生长的问题。

(二)技术方案

为实现上述包载靶标lncRNA Pvt1纳米粒子的水凝胶及其制备方法和应用解决现有技术中单一lncRNA的调控对重塑肿瘤微环境(TME)的影响易受TME中复杂基因调控网络的制约，不能有效抑制CRC术后复发、肝转移和远端瘤生长的问题，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种包载靶标lncRNA Pvt1纳米粒子的水凝胶及其制备方法，包括以下步骤：

1)含有编码Pvt1短发卡RNA的质粒(shPvt1)的构建：

shPvt1序列的设计经http://sirna.wi.mit.edu/查询获得，并利用T4 DNA连接酶将其克隆至pLKO.1-TRC载体中。随后经DNA测序验证该质粒的成功构建。