[发明专利]一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括人工脑脊液和脑组织修复液；

所述人工脑脊液由以下浓度的组分组成：62.5mM NaCl，12.5mM NaHCO₃，0.5mMNaH₂PO₄，1mM KCl，12.5mM D-葡萄糖，1mMCaCl₂，0.5mM MgCl₂，2.5mM L-抗坏血酸钠，1.5mM丙酮酸钠，0.01mM牛磺酸，2mM硫脲，7.5mM海藻糖，0.5mM犬尿酸，10μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮，50μM DL-AP5，0.5μM河豚毒素，5µg/ml放线菌素D；所述人工脑脊液的pH值为7.4；

所述脑组织修复液由以下浓度的组分组成：47.5mM N-甲基-D-葡萄糖胺，15mM NaHCO₃，0.6mM NaH₂PO₄，1.25mM KCl，10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，12.5mM D-葡萄糖，2.5mM L-抗坏血酸钠，1mM硫脲，1.5mM丙酮酸钠，5mM MgSO₄，0.25mM CaCl₂；所述脑组织修复液的pH值为7.4。

2.采用权利要求1所述的试剂盒分离灵长类动物神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）灌流液的配制：在权利要求1所述人工脑脊液，加入动物的体重0.0025%的肝素钠，混合后置于冰上持续通氧溶解，得冰冷的氧饱和灌流液；

（2）消化液的配制：在权利要求1所述人工脑脊液中加入35~45U/mL木瓜蛋白酶，15~25mg/mL胶原酶Ⅱ型，占消化液总体积0.4~0.6%的胰蛋白酶-EDTA和4~6 mg/mL脱氧核糖核酸酶I，混合均匀于34℃水浴锅加热10min且持续通氧，得消化液；

（3）消化终止液的配制：在上述人工脑脊液中加入消化终止液总体积8%的FBS，混合均匀后置于冰上且持续通氧，得消化终止液；

（4）细胞清洗液的配制：在PBS中加入细胞清洗液总体积0.01~0.04%牛血清白蛋白和细胞清洗液总体积0.01~0.04%的D-葡萄糖的混合液，置于冰上且持续通氧，得细胞清洗液；

（5）拉制玻璃吸管：在酒精灯上拉制口径为800μm、400μm和200μm的玻璃吸管，口径尖端尽可能抛平，以免吹打过程中损伤细胞；

（6）脑组织材料的获取：采用灌流液对动物进行心脏灌注，获取脑组织浸泡于冰冷的氧饱和脑组织修复液，然后对脑组织进行修整；脑组织修块后，切成300~500μm的脑片，并将脑片置于冰冷的氧饱和的人工脑脊液；

（7）将脑组织材料转移到预热的消化液进行消化，消化温度为34°C，消化时间为40~60min且持续通氧；

（8）在步骤（7）的消化液中加入消化终止液并吹打；

（9）将步骤（8）的溶液进行过滤，取滤液；

（10）将步骤（9）的滤液进行离心，取沉淀；

（11）去除步骤（10）的沉淀中的髓鞘、杂质和死细胞，得细胞沉淀；

（12）用细胞清洗液清洗步骤（11）的细胞沉淀，得所述灵长类动物神经元细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（10）中的离心温度为4°C，离心转速为1000rpm，离心时间为5min。