[发明专利]一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法

说明书

本发明公开了一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，属于生物细胞培养技术领域，本发明中将胚胎样干细胞做分组处理并进行培养，在培养基中加入外泌体抑制剂；提取并鉴定外泌体；所述起搏样干细胞产生外泌体miR‑127‑5p和miRNA，所述胚胎样干细胞产生外泌体NKx2.5，所述外泌体miR‑127‑5p通过靶向调节外泌体NKx2.5促进胚胎样干细胞分化成起搏样干细胞。本发明使我们更好地了解心脏起搏细胞的发生过程，有助于建立一套长期稳定高校生物起搏技术体系，为优化生物起搏器进入临床阶段提供新的策略。

技术领域

本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种促进胚胎样干细胞向起搏样细胞分化方法。

背景技术

干细胞分化的影响因素包括外源性影响因素和内源性影响因素。其中的干细胞分化的外源性因素包括细胞间的分化诱导、细胞间的分化抑制和细胞外物质的介导作用，而另外一方面的内源性影响因素包括基因的差异表达、基因表达水平的影响和奢侈基因影响，基因的差异性表达为干细胞的不对称分裂提供了基础，干细胞可以表达特定基因来分化成其他细胞。

基因差异表达是指基因指导下的蛋白质合成过程，生物体生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需要的各种酶和蛋白质的基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则要在特定的反应式表达。

基因的不同表达水平与基因的差异化表达相合配合，利于干细胞的分化作用发挥。奢侈基因即组织特异性基因，是指不同类型细胞中特异性表达的基因，奢侈基因的产物赋予各种类型细胞特异的形态结构特征与功能。多能干细胞具有高的自我更新能力、非免疫原性和可塑性，这使它们成为再生目的的理想来源。miRNAs是外泌体的主要功能成分之一，可能在细胞通讯和生物功能调节中发挥关键作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，可显著提高诱导干细胞向起搏样细胞分化的效率。

为达到上述目的，本发明提供一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，所述方法包括：将胚胎样干细胞做分组处理并进行培养，在培养基中加入外泌体抑制剂；提取并鉴定外泌体；所述起搏样干细胞产生外泌体 miR-127-5p和miRNA，所述胚胎样干细胞产生外泌体NKx2.5，所述外泌体 miR-127-5p通过靶向调节外泌体NKx2.5促进胚胎样干细胞分化成起搏样干细胞。

进一步地，所述胚胎样干细胞分组包括：培养所述胚胎样干细胞；所述起搏样干细胞和胚胎样干细胞共同培养；在培养基中加入外泌体抑制剂GW4869。

进一步地，所述外泌体miR-127-5p促进所述胚胎样干细胞分化包括如下步骤：

利用生物信息学网站预测靶向NKx2.5的共同miRNA，qPCR检测miRNA的表达情况；

通过生物学预测miR-127-5p与Nkx2.5的结合位点，设计荧光素酶报告基因实验证明miR-127-5p与Nkx2.5的启动子区结合。

进一步地，所述NKX2.5调节胚胎样干细胞化为起搏样干细胞包括如下步骤：通过RT-qPCR分析胚胎样干细胞分化成起搏样干细胞过程中不同时间节点细胞样本中Nkx2.5的表达水平；

构建NKX2.5敲除稳转株，qPCR、Western Blot、流式细胞术并检测基因表达。

进一步地，所述qPCR、WB检测相关mRNA的表达，免疫荧光检测各组中起搏相关蛋白表达水平，检测搏动频率并验证miR-127-5p的过表达可抑制 Nkx2.5的水平表达，进而促进胚胎样干细胞的分化。

进一步地，所述提取外泌体包括如下步骤：

培养皿的细胞汇合率达到80％时，把原有培养基吸掉，加0.25％胰蛋白酶进行消化；