[发明专利]运用荧光寿命成像揭示内质网修复机制的荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种运用荧光寿命成像揭示内质网修复机制的荧光探针及其制备方法和用途，涉及荧光探针技术领域，结构式如下：本发明提供一种荧光探针，该探针能够同时定位溶酶体和内质网，联合共聚焦成像和FLIM，不仅可以实时定量监测内质网的自噬、损伤程度及修复过程，从而揭示内质网的修复机制；而且发现了甘油三酯在内质网自噬过程中的修复作用，以及甘油三酯可能有部分抑制内质网自噬的作用。

技术领域：

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种运用荧光寿命成像揭示内质网修复机制的荧光探针及其制备方法和用途。

背景技术：

内质网(Endoplasmic reticulum，ER)是一种组织良好的细胞质膜质细胞器，富含核糖体和其他功能蛋白，包裹在磷脂双分子层中，磷脂膜的内翻创造了一个大的表面积来执行各种重要的生理功能，如蛋白质的合成、折叠和修饰以及细胞内磷脂和Ca²⁺离子的存储。此外，由于内质网具有加工和供应磷脂的能力，细胞中的大多数膜(如质膜、线粒体、高尔基体、核内体、溶酶体)与内质网活性密切相关。因此，在细胞从增殖、分化、衰老到最终死亡的整个生命周期中，ER是一个关键的细胞器。即使在正常生理状态下，细胞内内质网的完整性也经常被生化反应破坏并不断被修复。功能失调的内质网通过自噬(被溶酶体吞噬)自发去除应激，如活性氧(ROS)和药物的添加，增强内质网自噬和损伤，甚至可以触发细胞死亡。作为对损伤的回应，细胞有一种内在的机制来修复内质网。

透射电镜(TEM)可以确定内质网的超微结构及其与溶酶体的相互作用，而蛋白免疫印迹等集成技术可以量化自噬相关蛋白的表达水平。尽管有这些进展，这些技术仍不能监测活细胞中的动态ER行为。在这方面，荧光成像可以利用分子探针跟踪活细胞中许多细胞器(如ER、溶酶体、脂滴)的行为在内质网自噬研究中，具有独特发射的荧光探针可以同时标记内质网和溶酶体，但这些传统的荧光团在梳理内质网自噬和恢复的详细过程和机制方面存在以下问题。首先，目前的成像探针结合共聚焦显微镜无法量化内质网损伤的程度，因为释放到细胞质中的探针(受损的内质网被溶酶体处理后)发出的荧光信号与完整内质网中的相同。其次，多种探针的使用增加了内质网自噬，因为多种药物的联合细胞毒性，所以解决这些限制是至关重要的，不仅对于监测活细胞内内质网自噬和破坏的动态，而且对于理解内质网恢复的机制也是如此。

针对这个多方面的问题，我们设计了一种多功能探针，具有荧光颜色和寿命随环境变化而变化的特点。当与共聚焦显微镜相结合时，由于其在不同pH值下的独特发射，这一单一探针可以同时标记ER和溶酶体，结合荧光寿命成像显微镜(FLIM)可以区分ER膜上的染料和溶酶体消化后释放到细胞质中的染料。这种“一个探针两种成像模式(共聚焦和FLIM)”的方法是研究活细胞内质网自噬破坏和恢复的理想方法。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种荧光探针，该探针能够同时定位溶酶体和内质网，联合共聚焦成像和FLIM，不仅可以实时定量监测内质网的自噬、损伤程度及修复过程，从而揭示内质网的修复机制；而且发现了甘油三酯在内质网自噬过程中的修复作用，以及甘油三酯可能有部分抑制内质网自噬的作用。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种化合物，简写为RHC，结构式如下：

本发明的第二个目的是提供一种化合物RHC的制备方法，以罗丹明B作为起始原料，罗丹明B与乙二胺反应得到化合物1，化合物1与7-羟基-4-乙酸香豆素反应得到化合物RHC。

合成路线如下：

本发明的第三个目的是提供一种化合物RHC在制备荧光探针中的用途。

所述荧光探针同时定位溶酶体和内质网，对不同环境有着不同的荧光寿命响应。