[发明专利]一种通过基因编辑提高水稻抗病性的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种培育抗稻瘟病水稻品种的方法：通过基因工程方法将水稻植株中的OsWRKY70基因功能失活，以获得对稻瘟病抗性提高的水稻材料。利用本发明方法可对水稻稻瘟病的抗性进行遗传改良，但不影响水稻的正常生长发育。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过基因编辑提高水稻抗病性的方法及其应用。

背景技术

稻瘟病是世界各稻区最具危害性的水稻病害之一，严重影响稻米品质与产量，威胁世界粮食安全，是阻碍水稻优质、高产、稳产和保收的最主要因素之一。稻瘟病由丝状子囊真菌稻瘟病菌引起，具有流行速度极快等特点，在各个稻区经常发生，主要为害叶片、茎秆、穗部。稻瘟病所造成的产量损失一般为10％～20％，严重发病时可达到40％～50％，甚至颗粒无收。如2014年，我国稻瘟病危害面积达513.6万公顷，造成减产55.8万吨。由于稻瘟病菌小种的遗传复杂性与易变性，培育抗病与丰产、优质能相结合优良品种是水稻育种中长期艰巨的课题。目前，稻瘟病的防治主要通过化学农药防控，但该方法成本高、费时耗力，且严重危害生态环境和人类健康。实践证明，培育和种植抗病品种是控制稻瘟病最为经济、安全和有效的方法。传统育种耗时长、工作量大，且难以定向改良目标性状，随着功能基因组学和分子辅助设计育种技术研究的不断深入，常规抗病育种与生物技术相结合是高效、精准、快速培育抗病新品种的有效途径。

CRISPR-Cas9技术是设计一段sgRNA介导Cas9核酸酶对靶标位点进行特异性识别和靶向切割，并利用胞内易错修复机制引入突变。该技术操作简单、突变效率高、周期短、费用低，可以得到不含标记基因的种质资源，对种质资源创新和基因功能研究有重大意义。目前该技术精确地对水稻、玉米、小麦、高粱、番茄、马铃薯等农作物的基因组进行特异位点的修饰，能快速、准确、有效地定向改良品种性状，在改良农作物的特异基因表达、代谢调控、抗病虫害、胁迫反应、营养利用、产量与品质等性状中成功应用，为农作物品种改良提供了新的思路。

水稻基因组有许多WRKY转录因子参与了水稻免疫反应，如WRKY45正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性，WRKY62和WRKY76负调控水稻的免疫反应。已有研究表明OsWRKY70的表达受机械损伤以及虫害二化螟取食和褐飞虱取食的诱导，是一个虫害诱导防御网络中的关键节点。OsWRKY70正调控茉莉酸和胰蛋白酶抑制剂合成及水稻对二化螟的抗性，而负调控赤霉素、水杨酸、过氧化氢合成及水稻对褐飞虱的抗性。

发明内容

我们对日本晴水稻 OsWRKY70基因进行编辑，对基因编辑水稻株系进行DNA测序分析，与 OsWRKY70基因序列相比，发现基因编辑株系CRS6，8和9株系在 OsWRKY70编码区的347位插入一个A，CRS7株系在347位插入一个T（图2），该位点一个碱基的插入导致基因编辑株系中OsWRKY70蛋白在116位发生移码，并且在177位氨基酸处提前终止蛋白编码，导致这些水稻株系中OsWRKY70蛋白的功能缺失(图3)。我们对基因编辑水稻田间的全生育期农艺性状观察，发现该基因编辑不影响水稻的正常生长发育和农艺性状；对基因编辑水稻材料CRS7和CRS9进行抗病性分析，二叶一心期喷雾接种稻瘟病菌小种R01-1，发现其叶片上病斑数目明显少于野生型叶片上病斑，表明OsWRKY70基因编辑能提高水稻对稻瘟病的抗性。

本发明提供的技术方案是：一种培育抗稻瘟病水稻品种的方法，通过基因工程方法将水稻植株中的OsWRKY70基因功能失活，以获得对稻瘟病抗性提高的水稻材料。

上述的方法，所述基因工程方法选自物理或化学诱变、同源重组、基因编辑。

上述的方法，所述基因编辑是CRISPR-Cas9基因编辑方法。

上述的方法，所述OsWRKY70基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。