[发明专利]一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法

说明书

本发明公开了一种人巨细胞病毒重组抗原（CMV重组抗原pp150）的纯化方法，涉及蛋白纯化技术领域。本发明从含有GST‑pp150抗原的大肠杆菌中进行目的蛋白纯化。本发明所述方法，可有效去除绝大多数宿主蛋白质，使其对目的蛋白的后续应用的影响降到最低；去除杂蛋白及相关物质，最终使目的蛋白产品纯度达到95％以上。本发明采用的亲和层析方法可放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，特别涉及一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法。

背景技术

巨细胞病毒(CMV)属疱疹病毒科（Herpesviridae），是一种双链DNA病毒。巨细胞病毒在人群中感染非常普遍，可以在被感染个体中终生潜伏。巨细胞病毒是TORCH病原体的一种，虽然对正常人而言，其感染通常无症状，但巨细胞病毒对胎儿和免疫力低下者的危害非常大。感染病毒的孕妇，可导致胎停，流产或胎儿畸形；对于免疫低下个体，特别是新生儿和器官移植患者，原发性感染和重新激活的巨细胞病毒感染会产生严重的并发症，损伤听觉神经，引起肝脏疾患乃至危及生命。对巨细胞病毒的诊断可以减少病毒感染孕妇，育龄妇女，以及其他高风险人群。

目前，已知为数不多的几种巨细胞病毒编码蛋白具有免疫活性，其中pp150抗原性较强，常被用来诊断检测巨细胞病毒感染的IgM抗体。

由于CMV感染所致症状和体征多是非特异性的，而且许多感染者并不表现任何症状，因此必须结合实验室诊断才能确诊。目前多用血清学方法诊断CMV感染。机体感染CMV后，首先会产生IgM抗体，一般在感染后的1-2周出现IgM，且在体内持续时间较短，约一个月后会逐渐转阴，是机体近期感染CMV的一项参考标志。而机体产生CMV-IgG抗体的时间相比IgM较晚，且CMV-IgG抗体的浓度水平会持续升高，在1-2个月后出现高峰值，且在体内持续时间较长，是机体既往感染CMV的一项参考标志，通过观察CMV-IgG抗体能够对机体CMV免疫力进行判断。酶联免疫吸附实验（ELISA）由于其操作简便、快速以及设备要求低等原因，成为检测IgG、IgM最常用的方法之一。利用有限的几种CMV蛋白能与不同临床感染阶段的阳性血清中的IgG、IgM抗体反应，识别并筛选特异性强的抗原蛋白，应用基因工程技术进行高效的表达，有助于快速、便捷地纯化生产抗原原料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，该方法得到高纯度人巨细胞病毒重组抗原，有助于高效、便捷地纯化生产抗原原料。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法，包括以下步骤：

步骤（1）、将含有重组表达的人巨细胞病毒重组抗原菌体沉淀放入平衡缓冲液中搅拌，菌体重悬均匀后进行超声破碎，超声破碎后的破碎液经离心后，收集上清液；

步骤（2）、将步骤（1）中得到的上清液进行滤器过滤处理；

步骤（3）、将步骤（2）中过滤处理后的上清液上样到亲和层析柱，经过洗涤步骤去除杂蛋白，再采用解离液洗脱得到含有目的蛋白的洗脱峰；

步骤（4）、将步骤（3）中得到的洗脱缓冲液透析于保存缓冲液中，进行后续的分析鉴定。

进一步的，所述步骤（1）中，超声破碎功率200W，超声破碎99次，每次超声破碎时间4s，相邻两次超声破碎间隔8s；离心转速为15000 rpm，离心时间为30 min，离心在4℃下进行。

进一步的，所述步骤（2）中，使用滤器过滤的过滤孔径为0.45μm。

进一步的，所述步骤（3）中，所述亲和层析柱为GST标签蛋白纯化柱，洗脱液为50mM Tris+10 mM GSH，pH 8.0。

进一步的，所述步骤（4）中，透析采用的透析袋截留分子量8 kD-14 kD，缓冲液为10 mM PBS+20%甘油，pH7.4。