[发明专利]从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用。本发明的试剂中结合缓冲液的配方简单，成本低廉，可以显著提高核酸与磁珠的结合效果，增加核酸的结合量。本发明将特定组成的裂解缓冲液、结合缓冲液和洗涤缓冲液组合使用，先充分裂解组织细胞，消化与核酸结合的蛋白质，完全释放出核酸，再将释放出的核酸特异性地结合到磁珠上，增大核酸的结合量，实现核酸与其他裂解物的有效分离，之后多次洗涤结合有核酸的磁珠，彻底去除蛋白质、脂质等杂质，最后从磁珠上洗脱核酸，得到高纯度、高收率的核酸。本发明的试剂/试剂盒组成简单，成本低廉，便于核酸提取操作，可以大幅度缩短提取时间。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

随着精准医疗对病理科的影响渗透以及研究手段的不断升级，病理医生除了关注传统组织形态外，对FFPE(Formalin Fixation and Paraffin Embedding，福尔马林固定石蜡包埋)样本在分子层面的研究也越来越多。FFPE样本大部分与肿瘤相关，所以研究这些组织样本为探讨新的肿瘤分类、诊断和预后标准，开发肿瘤早期检测的实验技术、转化医学和个体化医学提供了有利的依据。

FFPE样本虽然使组织得以长期保存，但其特殊的制作方法和保存方式也会对核酸分子造成多方面的影响。首先，福尔马林固定液中含有的甲醛具有较高的反应活性，可以与带有-OH、-SH、-NH₂的分子发生亲核加成反应，并最终成为-CH₂-的提供者。当甲醛与上述基团中的两个发生反应后，自由的分子链也被交联起来，从而发挥对组织的固定作用，该过程也会对核酸分子产生不利的影响，Watford等(1998)的研究发现，核酸对甲醛的反应性最初表现为核酸分子呈可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，随着固定时间的延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，这也使核酸链的脆性增加，在受到剪切力作用时更容易发生随机断裂。一般而言，甲醛介导的DNA损伤在固定3h后已经发生，固定时间越长，DNA损伤越严重，越不易获得大片段DNA。其次，用于组织包埋的固体石蜡为多种烷烃的混合物，其熔点为50-65℃，化学性质稳定，在通常条件下不与酸性或碱性溶液发生反应，且目前尚无石蜡能直接导致包埋组织中DNA降解的报道。但是有文献记载，在石蜡包埋过程中DNA更容易发生降解，其原因可能是组织浸蜡与包埋时需要加热到62℃左右，此温度下DNA部分解链，组织内残留的痕量甲醛对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而发生降解。另外，石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，减少蛋白酶K(PK)与组织内蛋白的接触，从而影响组织消化和DNA释放。

为了解除甲醛固定所致DNA-蛋白质、RNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质之间的交联，美国专利US2005014203A1(Expression Pathology)公开了一种解交联方法，先将固定的生物样品加热(如95℃加热1.5h)，以便部分断开生物分子之间的交联，然后将处理过的样品与蛋白水解酶如蛋白酶K一起孵育，分解组织和细胞结构。由于该方法需要在相对较高的温度下解交联，且在中等温度下解交联速度非常缓慢，因此，美国专利US20090202998A1(Qiagen)公开了一种能在相对较低的温度下解交联的方法，包括：使固定的生物样品与亲核试剂(选自乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、2-氨基-1,3-丙二醇、氨基胍等)接触，在65-85℃下孵育一段时间，快速断开交联。此外，由于交联可通过加热的方式逆转，样品中过量的甲醛将阻碍任何涉及氨基的功能蛋白质、核酸等的加工或分析。为防止过量的甲醛再次形成交联、阻止有效的交联逆转，中国专利CN102803490B(Qiagen)公开了一种核酸提取方法，将生物样品与包含清除剂(如己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼)的溶液接触，通过与甲醛反应将其去除。