[发明专利]一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用，属于生物技术领域。采用的方案包括：将乙酰胆碱受体的各个亚基与空载质粒按照一定的比例进行共同转染，再经过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干处理，制得检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。该方法与放免法和酶联免疫法相比，具有较高的灵敏度；与现有技术的文献所报道的免疫荧光方法相比，在降低了背景的同时提高了检测的特异性。因此，无论从研究角度还是作为重症肌无力疾病的辅助诊断手段，本发明均具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用。

背景技术

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的神经-肌肉接头(NMJ)处传递障碍的自身免疫性疾病，病变主要累及NMJ突触后膜上乙酰胆碱受体(acetyl cholinergic receptor，AchR)。目前，检测重症肌无力自身抗体的方法主要有放免法，酶联免疫法等。现已有证据表明，有部分重症肌无力症状的患者样本通过放免法检测的结果为阴性，酶联免疫吸附法与放免法存在同样的问题。以细胞为底物的免疫荧光法(CBA，Cell Based Assay)克服了上述两种方法的缺点，通过在细胞表面表达出完整且有正确构像的AchR抗原，可检出放免法或酶联免疫法检测后阴性或低滴度重症肌无力患者，提高了重症肌无力患者血清的阳性检出率。因此，AchR免疫荧光方法的广泛应用可以为疾病的早期诊断及后续治疗提供有效的帮助。

Rapsyn是突触后膜乙酰胆碱受体缔合蛋白，由肌肉细胞表达，被认为是一种“生物锚定蛋白”，Rapsyn通过与乙酰胆碱受体互作，以催化它们的聚集，从而确保神经递质的传递(M K,Ramarao.J B,Cohen.Mechanism of nicotinic acetylcholine receptorcluster formation by rapsyn.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998,95:4007-4012)。现有AchR自身抗体的CBA法，均是通过将Rapsyn与AchR的α、β、δ、ε和/或γ亚基按照一定比例进行瞬时或稳定转染，通过Rapsyn聚集作用，将AchR的各亚基表达于HEK293细胞表面，然后对过表达的细胞进行固定后检测患有重症肌无力症状的样本(Guang Zhao,Xiaoqing Wang,Xiaowen Yu,et al.Clinical application of clustered AchR for the detection ofSNMG.Scientific Reports.2015,5:10193.欧蒙医学实验诊断股份公司申请专利：用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法.管阳太申请专利：一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法)。但是，Rapsyn作为一种自身抗原，将其与AchR各亚基进行瞬时转染获得过表达AchR的抗原细胞均会有Rapsyn抗原的表达，从而在进行样本检测时，有可能无法区分Rapsyn与AchR抗体阳性(Agius MA,Zhu S,Kirvan CA,etal.Rapsynantibodies in myasthenia gravis.Ann N Y Acad Sci.1998,841:516-21)。有数据表明，在重症肌无力患者的血清中，Rapsyn自身抗体的阳性率高达15％。但是，目前却没有证据表明rapsyn抗体阳性和重症肌无力的严重程度或某一类亚型有关，与此同时，在一些其他类型的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮中检测到了rapsyn抗体。因此，有必要提供一种仅含有过表达AchR各亚基(αβδε和/或γ亚基)的细胞爬片，在现有技术的基础上，增加AchR自身抗体检测的特异性。