[发明专利]一种基于三代全长和二代转录组测序挖掘花椒叶片萜类化合物合成关键基因的方法

说明书

本发明公开了一种基于三代全长和二代转录组测序挖掘花椒叶片萜类化合物合成关键基因的方法，包括：测定竹叶花椒与其芽变品种荣昌无刺花椒三个不同发育时期叶片中的萜类化合物的成分及含量；提取叶片的总RNA构建测序文库，数据分析并功能注释。预测了CDS、SSR、lncRNAs和As事件，分析差异表达基因并筛选与萜类化合物生物合成相关的结构基因与转录因子的差异表达基因；构建共表达基因网络，将hub基因的FPKM值与萜类化合物含量进行相关性分析，选取与萜类化合物含量正相关的基因作为其合成相关基因。本发明成功构建了花椒高质量的转录本，揭示了12个可能参与调节萜类化合物合成的关键基因，为解析花椒叶片萜类物质生物合成的分子机制奠定了基础。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于 三代全长和二代转录组测序挖掘花椒叶片萜类化合物合成关键基因的方法。

背景技术

花椒是芸香科花椒属落叶小乔木，是一种重要的经济作物树种，广泛种植 于中国、韩国和日本等亚洲国家。全世界约有250种花椒，其中竹叶花椒为中 国主栽品种之一，在我国具有悠久的栽培历史。竹叶花椒又称四川青花椒，其 果实、果皮、叶片和树皮等组织均富含精油，且具有浓郁的麻香味，而萜类化 合物为花椒主要风味成分物质，并被广泛运用于医药和食品中，具有重要的经 济价值。

萜类化合物在植物中有两种生物合成途径，即甲羟戊酸(MVA)和2-甲基 -D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径。药理学研究证明，萜类化合物具有抗炎、抑 菌、抗氧化、细胞毒性等多种生物活性，因此引起了研究者的广泛关注。在生 物防治中，萜类化合物可作用于昆虫神经细胞膜受体以改变离子通道，抑制昆 虫的神经传导，从而使昆虫中毒和驱避。对人类而言，萜类化合物可用于改善 糖尿病，促进宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性，清除自由基等作用。有研究发 现不同发育期的花椒叶片精油成分和含量存在显著差异。因此，根据花椒不同 发育时期叶片中不同萜类化合物的含量来确定精油提取的叶片发育时期，以达 到竹叶花椒叶片的最大利用率，提高花椒的收益。

花椒叶片的相关研究主要集中于鉴定和测定抗氧化剂、类黄酮、木脂素和 酰胺等活性物质。然而，利用SMRT-seq技术筛选候选基因以确定花椒叶片中萜 类生物合成的分子机制尚未见报道。竹叶花椒具有非常复杂的遗传背景和庞大 的基因组。目前，缺乏高质量的基因组数据，阻碍了对该植物的进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于三代全长和二代转录组测序挖掘花椒叶 片萜类化合物合成关键基因的方法，本发明以竹叶花椒(ZY)及其芽变品种荣 昌无刺花椒(WC)为研究材料，将转录组测序(第三代和第二代)与萜类化合 物的测定结合分析，以鉴定竹叶花椒中萜类化合物合成的关键基因，并阐明萜 类化合物的生物合成途径和调控机制，完善了花椒转录组数据资源，为后期研 究花椒叶片萜类化合物合成代谢途径中的关键酶基因的克隆、表达分析和功能 研究提供基因资源，同时也为解析花椒叶片中萜类化合物的生物合成的分子机 制奠定基础，进一步加强花椒叶片的开发利用，也为利用基因工程技术提花椒 叶片中萜类化合物的含量提供了遗传数据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于三代全长和二代转录组测序挖掘花椒叶片萜类化合物合成关键基 因的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、测定了竹叶花椒和荣昌无刺花椒的三个不同发育时期，即幼叶、成 熟叶和老叶中的萜类化合物的成分和含量，比较差异；

步骤2、分别提取竹叶花椒和荣昌无刺花椒的幼叶、成熟叶和老叶的总RNA， 并提取竹叶花椒和荣昌无刺花椒幼叶、成熟叶和老叶时期混合样的总RNA，分 别测序并构建全长转录组以及转录组数据集，获得原始数据；

步骤3、对步骤2获得的原始数据进行校正后得到高质量序列，将高质量序 列过滤后得到干净数据，将所述干净数据进行组装处理，获得竹叶花椒与荣昌 无刺花椒的全长转录组数据库和转录组数据库；