[发明专利]构建谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌的方法

说明书

本发明公开了一种构建谷胱二肽生产菌的方法，包括以下步骤：在酿酒酵母菌基因组中整合入一个以上拷贝的γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶基因gshA，筛选得到生产谷胱二肽的酵母菌。

技术领域

本发明属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种产谷胱二肽的酿酒酵母工程菌的构建方法。

背景技术

谷氨酸-半胱氨酸二肽又称γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸、γ-Glu-Cys，简称谷胱二肽，其CAS号636-58-8，分子式如下。

谷胱二肽是人体内与甘氨酸通过谷胱甘肽合成酶(gshB)合成L-谷胱甘肽(GSH)的底物，人体细胞内谷胱二肽含量很低，但人体细胞可以从外源摄取谷胱二肽快速提升GSH的水平。天然食物中，谷胱二肽一般在牛奶中存在，特别是乳清成分中，其往往以二硫键的形式连接到蛋白上。临床研究证明，HIV病人通过摄取乳清蛋白提取物可以提升人体谷胱甘肽水平。乳清提取物的谷胱二肽已经用于添加到食品和化妆品，也用来治疗遭受重金属或氧化剂中毒的病人。

目前谷胱二肽的合成方法包括化学合成法和酶催化法，但是目前还没有可以工业化进行稳定、低成本生产谷胱二肽的方法，化学法涉及复杂的保护和去保护修饰，工艺复杂，收率太低；酶法，一般需要使用经过甲醇或乙醇酯化的氨基酸底物作为原料，原料的限制性和可获取性不足，限制了工业化生产。

也有人研究了采用微生物发酵法来制备谷胱二肽。发酵法采用廉洁易得的培养基中碳源、氮源作为起始原料，近些年来逐渐成为新研究方向，例如CN104164381A公开了利用大肠杆菌(Escherichia coli)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)发酵来制备γ-谷氨酰半胱氨酸。但目前报道的微生物都是细菌，还没有报道利用真菌比如酵母菌发酵来制备谷胱二肽的研究进展。

考虑到目前谷胱二肽主要用于食品、药品和化妆品，而大肠杆菌因含有内毒素，且普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致通过某些细菌特别是有致病性风险的细菌发酵获得的谷胱二肽难以向医药、食品和化妆品等行业推广使用。

发明内容

要克服这种市场销售障碍，提高谷胱二肽被食品、保健品和药品销售商和消费者的接受度，发明人尝试了通过公认安全微生物(GRAS)比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等作为菌种通过发酵来生产谷胱二肽的可行性，终于在酿酒酵母中取得了成功，尤其是开发出了通过发酵生产谷胱二肽、但不生产谷胱甘肽的酿酒酵母S288C工程菌，这些研究进展构成了本发明的基础。

本发明的第一个目的在于提供一种构建谷氨酸-半胱氨酸二肽(简称谷胱二肽)生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.在酵母菌基因组中整合入一个以上、优选两个以上、更优选三个以上拷贝的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.2，又称glutamate-cysteine ligase，谷氨酰半胱氨酸连接酶)基因gshA，筛选阳性克隆；

B.筛选得到生产谷氨酸-半胱氨酸二肽(谷胱二肽)的酵母菌。

上述酵母菌可以选自酿酒酵母和面包酵母。

优选地，上述酵母菌是酿酒酵母S288C。

在一种实施方式中，上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶可以是大肠杆菌来源的gshA酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

为了在酵母菌例如酿酒酵母中表达外源的大肠杆菌来源的gshA酶，对其编码基因进行密码子优化，例如上述基因gshA的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:2。

上述步骤A中可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将基因gshA整合入酵母菌基因组。