[发明专利]一种基于WST-8显色反应测定活菌总数的方法

说明书

本发明提供了一种基于WST‑8显色反应测定活菌总数的方法，包括以下步骤：将重悬后的待测细菌悬液与显色底物溶液混合反应0.5‑4h，得到待测反应液；通过测定反应液的吸光度值，得到活菌总数。显色底物溶液包括2‑(2‑甲氧基‑4‑硝基苯基)‑3‑(4‑硝基苯基)‑5‑(2,4‑二磺基苯基)‑2H‑四唑鎓盐、电子载体1‑甲氧基‑5‑甲基酚嗪硫酸甲酯盐和细菌生长营养物质。本发明首次利用WST‑8的显色反应来进行活菌检测，显色底物溶液中细菌生长营养物质的存在能有效提高细菌细胞中脱氢酶含量，从而提高细菌检测的灵敏度，该方法具有操作方便、检测方法快速、灵敏度高、细菌检测范围广的特点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于WST-8显色反应测定活菌总数的方法。

背景技术

细菌在环境中无处不在，人类每天都接触着各种细菌，其中的大多数细菌对人类无害，许多甚至与宿主形成了有益关系。然而致病菌会导致人类感染，感染所需的细菌数量通常很少，并且这些细菌的耐药性也在不断增加，对公共健康构成了严重威胁。因此，细菌总数是国际饮用水、食品等卫生细菌学的公认指标。为了保证人类的生命健康、提高人类的生活环境，测定水质、食品等中的细菌总数是非常有必要的。

迄今为止，已经报道的细菌检测方法包括比浊法、平板计数法、抗体测定法，聚合酶链反应法等。其中，比浊法操作简单，但不能区分活菌和死菌；平板计数法是临床诊断的金标准，可以通过直观地计算平板上细菌的菌落形成单位，在一定程度上给出活菌的总细胞数，但它需要一系列的样品稀释和1-2天的培养时间，步骤繁琐；抗体测定法中使用抗体作为识别单元来提供选择性和灵敏度，但抗体的生产昂贵耗时，且检测灵敏度有限；核酸扩增技术需要经过DNA提取和信号放大等繁琐的样品预处理步骤。

由于活菌具有代谢活性，因此通过直接和间接测量细菌呼吸，例如通过直接评估电子载体和四唑盐的还原反应间接测定电子传递的方法来检测活菌数目，是非常有前景的。评估微生物种群代谢活动最常用的四唑盐之一是3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)。通过测定MTT和细菌脱氢酶反应产生的甲臜在480nm处的吸光度即可确定细菌的数目。但该反应的反应时间较长(一般为4小时)，反应产物甲臜水溶性差，在操作过程中需要进一步加入有机溶剂溶解甲臜，步骤繁琐；同时有机溶剂和MTT均具有一定的生物毒性，这些都限制了MTT方法的进一步发展。作为MTT的改良化合物-WST-8，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐，生物毒性低，可以在电子偶联试剂的存在下，在较短的时间内被细胞脱氢酶还原形成与微生物的数目成正比的水溶性橙黄色甲臜，且不需后续溶解等处理步骤。基于WST-8显色反应的检测方法在细胞增殖和细胞毒性检测中广受欢迎。然而，该方法未见用于细菌检测，这可能是由于脱氢酶主要分布在线粒体内膜上，而细菌没有线粒体结构，细菌中脱氢酶的含量相对细胞中而言较少；另一方面细菌细菌壁的存在使得显色试剂WST-8和电子载体难以进入细菌，显色反应难以发生，灵敏度较低，因而缺乏对其在细菌中的应用研究。

有鉴于此，有必要设计一种测定活菌总数的新方法，来提高细菌检测的灵敏度，简化检测步骤，解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于WST-8显色反应测定活菌总数的方法，通过在测试过程中加入营养物质，将细菌重悬后进行检测，实现了基于WST-8显色反应测定细菌活菌总数的方法，具有操作方便、检测方法快速、灵敏度高、细菌检测范围广的特点。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种基于WST-8显色反应测定活菌总数的方法，包括以下步骤：

S1.配制包含WST-8和电子载体的显色底物溶液；

S2.将待测活菌样品用PBS缓冲溶液进行重悬，制备待测菌悬液；

S3.将步骤S2得到的待测菌悬液与步骤S1得到的所述显色底物溶液混合反应预设时间，得到待测反应液；