[发明专利]细胞色素P450功能研究及在灵芝三萜合成中的应用

说明书

一种细胞色素P450功能研究及在灵芝三萜合成中的应用，在酿酒酵母细胞中采用双质粒抗生素调控表达系统，通过将GL21117在一个质粒中进行表达调控，以及将GL20421和GL21117两个基因在两个质粒中同时进行表达调控这两种方式，在保证GA‑HLDOA前体产量的同时，获得一类灵芝三萜，包括：3,15‑二羟基‑羊毛甾‑8,24‑二烯‑26‑酸、灵芝酸Y、3,15,30‑三羟基‑羊毛甾‑8,24‑二烯‑26‑酸、7‑氧代‑3,15‑二羟基‑羊毛甾‑8,24‑二烯‑26‑酸和24,25‑二烷基‑3,30‑二羟基‑羊毛甾‑8‑烯基‑26‑酸。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种细胞色素P450功能研究及在灵芝三萜合成中的应用。

背景技术

由于灵芝生长周期较长，不易培养，灵芝中代谢产物丰富且含量相对较低，且缺少成熟全面的灵芝真菌细胞基因操作手段等因素，研究人员对灵芝三萜类化合物生物合成途径的认知较为匮乏且进展缓慢。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种细胞色素P450功能研究及在灵芝三萜合成中的应用，在酿酒酵母细胞中采用双质粒抗生素调控表达系统，通过将GL21117在一个质粒中进行表达调控，以及将GL20421和GL21117两个基因在两个质粒中同时进行表达调控这两种方式，在保证GA-HLDOA前体产量的同时，对两个酶的多种功能进行研究，从而获得了一系列新的尚未报导的灵芝三萜类化合物，在揭示这些灵芝三萜在灵芝中的生物合成途径的同时，实现了这些化合物在酿酒酵母细胞中的异源生物合成。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一类灵芝三萜，包括：3,15-二羟基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸(15-hydroxy-ganoderic acid HLDOA)、灵芝酸Y(Ganoderic acid Y)、3,15,30-三羟基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸(15,30-dihydroxy-ganoderic acid HLDOA)、7-氧代-3,15-二羟基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸(7-oxo-15-hydroxy-ganoderic acid HLDOA)和24,25-二烷基-3,30-二羟基-羊毛甾-8-烯基-26-酸(24,25-dialkyl-30-hydroxy-ganoderic acidHLDOA)，其结构式依次为：

和

本发明涉及上述灵芝三萜的制备方法，包括：通过P450基因GL21117催化灵芝酸Ganoderic acid HLDOA形成的新的灵芝三萜或通过P450基因GL21117与P450基因GL21117共同催化Ganoderic acid HLDOA形成的新的灵芝三萜，即将两个P450基因GL20421和GL21117分别或共同克隆到酿酒酵母过表达质粒中，并将酿酒酵母过表达质粒分别转化至重组改造后的微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵实现。

所述的P450基因GL20421的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，其氨基酸序列如SeqID No.2所示；所述的P450基因GL21117的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，其氨基酸序列如Seq ID No.4所示。

所述方法具体包括以下任意一种：