[发明专利]一种基于碱基序列匹配分组的免疫细胞受体转录组多样性检测多重引物智能选择方法

说明书

本发明公开了一种基于碱基序列匹配分组的免疫细胞受体转录组多样性检测多重引物智能选择方法，包括将m条FR3序列切分成不同长度的子串、子串去重，进一步根据子串筛选条件(引物长度、退火温度、CG含量)筛选出符合要求的子串集，通过加权选择子串，将原始碱基序列进行分组，在分组数尽可能少的情况下使得每个组的公共连续子串尽可能的长，最后筛选出最优的简并引物集，极大的提高了引物设计效率，有效降低实验难度及成本。

技术领域

本发明涉及免疫组库的多重引物自动筛选技术领域，具体涉及一种基于字符串匹配和加权选择子串并进行分组的多重引物智能选择方法。

背景技术

免疫组库(Immune Repertoire，IR)是指在任何指定时间，个体的循环系统内所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。免疫系统的多样性对机体健康至关重要，其多样性越丰富，机体的免疫系统就越健康，识别并清除抗原的能力就越强。机体的获得性免疫能识别无数种抗原分子，并随之做出反应。其分子基础为T细胞表面受体和B细胞表面受体(TCR和BCR)特异性识别抗原区段，激活免疫应答。免疫系统中T细胞库和B细胞库分别包含了所有特异性不同的T细胞克隆和B细胞克隆。这种识别受体的多样性在基因重排过程中产生，多样性体现为受体基因V(D)J片段重组。其中以人类Ig重链为例，其排列组合的种类可达40(VH)×25(VD)×6(VJ)＝6000之多。以此类推，Vκ和Vλ的V、J基因片段的组合种类分别达200余种和120余种。理论上IgV区基因片段的组合加上轻重链组合后的多样性约为1.9×10⁶。TCR基因群与BCR基因群的结构相似，其重排过程也相似。TCRβ基因群可变区包括Vβ、Dβ、Jβ三类基因片段，TCRα基因群包括Vα、Jα两类基因片段，不同基因片段及不同链的组合可产生10¹⁶种可能性，因此分析多样性主要是分析V(D)J片段的序列特征。

目前关于免疫组库NGS制备技术包括多重PCR与5’RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)。其中RACE法在逆转录、TdT加尾、PCR扩增这三个连接的酶促反应过程中，任何一步的失败都会导致前功尽弃。即便是上述反应平稳顺利，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物，且成本较高。相比之下，多重PCR建库简单易行、成本低等优点便体现出来，成为免疫组库建库的优选方法。但是多重PCR存在一个弊端就是不同引物之间会形成引物二聚体，且引物对数越多，二聚体现象越严重，这就大大降低了引物的扩增效率。而且，引物对数越多，实验成本就越高，难度也越大，因此如何用最少的引物扩增最多的文库便成为了一个挑战。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明给出了一种基于碱基序列匹配分组的免疫细胞受体转录组多样性检测多重引物智能选择方法，通过整合不同V区基因的相对保守区段(FR3)，进行切分、匹配和分组，通过引物长度、退火温度、CG含量等参数设定，从上百条基因中筛选得到30-50条简并引物，大大降低了实验所需的引物对数。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于碱基序列匹配分组的免疫细胞受体转录组多样性检测多重引物智能选择方法，包括以下步骤：

S1：对于m条FR3碱基序列S_i(i＝1,2,...,m)，采用滑动窗口将每条序列切分成不同长度的连续子串，得到所有序列不同长度的子串集；

S2：将所述所有序列不同长度的子串集去重，得到去重后的子串集；

S3：通过子串筛选条件(引物长度、退火温度、CG含量)对所述去重后的子串集中的子串进行筛选，去除不满足条件的子串后，得到子串集P＝{p₁,p₂,...,p_n}，子串集中某个子串表示为p_j(j＝1,2,...,n)，计算其长度为len(p_j)；