[发明专利]一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。属于玉米改良技术领域。本发明提供了单倍体诱导版的糯性玉米改良单倍体诱导系Hi‑Edit3与Hi‑Edit8；对目标自交系进行单倍体诱导；通过双分子荧光技术在幼胚、成熟籽粒及萌发籽粒的下胚轴水平高效筛选单倍体；单倍体鉴定及靶位点基因型鉴定；单倍体诱导加倍，最终实现两个世代内快速改良获得糯性玉米，具有很高的育种应用价值。

技术领域

本发明涉及玉米改良技术领域，更具体的说是涉及一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。

背景技术

玉米是重要的粮食作物，同时在饲料和工业原料等领域具有广泛的应用。玉米淀粉是玉米的重要的加工产物，作为一种绿色的基础性原料，具有很高的应用价值和经济价值，甚至在食品、制药等诸多国民经济领域发挥了不可替代的作用，因此培育和改良糯性玉米具有极其重要的意义。

CRISPR/Cas9这项基因编辑技术是源于细菌或古细菌的规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统。该系统包括一段人工设计的sgRNA，这段RNA通过碱基互补配对识别靶标DNA序列，引导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发体内的双链断裂修复机制，进而实现对目标基因位点的编辑。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术在动植物等各类领域应用广泛，尤其对于作物遗传改良上具有重大的应用价值。

单倍体育种技术为作物遗传改良提供了新的方法，目前已报道玉米ZmMTL及ZmDMP基因的单倍体材料可以诱导形成单倍体，前期研究表明利用ZmMTL基因突变获得的单倍体诱导率在4.7％～11％之间，ZmMTL与ZmDMP基因同时突变的单倍体诱导率在6.9％～11.5％之间。

优良材料的育种需要快速高效的技术，传统育种技术遗传纯合需要8个世代相比，双单倍体(DH)育种技术只需两代即可获得纯系，具有重要的技术优势与育种实践价值。虽然双单倍体育种技术可缩短育种周期，但无法定向精准改变某一农艺性状；CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了精准改良目标性状目的，我们前期通过将携带有靶向基因突变CRISPR-Cas9转基因元件的转基因材料与需要改良的受体材料进行杂交，利用导入的CRISPR-Cas9转基因元件对受体材料靶向基因进行编辑，以完成受体材料靶向性状的改良，然而，该过程需要将在BC2世代通过自交，筛选获得高背景回复、受体转变成糯性种质且不携带转基因元件的亲本

因此，如何提供一种快速定点突变创制糯性玉米种质的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速定点突变创制纯合糯性玉米种质的方法及其应用。能够在两个世代内实现任意玉米品种改良为糯性品质。本发明通过前期突变ZmMTL基因并叠加双荧光筛选系统的单倍体诱导系的基础上，进一步叠加能够定点突变ZmWaxy1基因的CRISPR-Cas9转基因元件，实现单倍体诱导介导快速改良玉米糯性性状的育种。同时，创制了玉米ZmMTL及ZmDMP双基因突变纯合体叠加双荧光筛选系统与ZmWaxy1基因编辑CRISPR-Cas9元件的单倍体诱导编辑ZmWaxy1基因株系。将受体材料与单倍体诱导基因编辑系再交，利用ZmMTL或ZmMTL与ZmDMP突变纯合体获得孤雌生殖单倍体，配合双荧光系统筛选单倍体，最终获得改良受体材料的糯性单倍体，利用染色体加倍技术，加倍获得单双倍体自交即可获得目标改良材料。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速定点突变创制糯性玉米种质的方法，包括：将mtl突变纯合体且ZmWaxy1基因敲除元件和筛选元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系，或mtl和dmp突变纯合体且ZmWaxy1基因敲除元件和筛选元件纯合的玉米ZmWaxy1基因编辑单倍体诱导系和玉米自交系进行杂交，杂交后代经单倍体筛选与鉴定，获得的单倍体诱导系通过染色体加倍，获得糯性改良的双单倍玉米种质。