[发明专利]一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用

说明书

本发明提供一株溶藻弧菌pstS基因沉默菌株，所述菌株为Vibrio alginolyticus pstS‑RNAi，已于2021年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2021764。本发明通过比较转录组学分析技术，结合RNA干扰这一定向高效的基因沉默技术，构建一株溶藻弧菌pstS基因沉默菌株，并对该菌株的毒力效果进行检测。所构建的溶藻弧菌pstS基因沉默菌株不仅可用于研究溶藻弧菌的致病机理，还可用于研制预防或治疗溶藻弧菌病的疫苗，为溶藻弧菌病的预防和治疗寻找新的靶点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用。

背景技术

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，是一种广泛存在于海洋和河口，可以从病人体内、海水、水产品等多种不同环境中分离得到的革兰氏阴性杆菌。溶藻弧菌除了可引起鱼、虾、贝类等水产品患病与大量死亡，造成严重的经济损失外，还可感染人体引起皮肤感染、外耳道感染等多种疾病。目前，用于防治溶藻弧菌的药物主要是抗生素，抗生素的不当使用容易产生细菌耐药性、导致药物残留等危害。因此，亟需开发防治溶藻弧菌病的生物药物或者疫苗。

磷的吸收和利用在生物体遗传、能量代谢、细胞膜的完整性和细胞内信号传递等生物过程中发挥着重要的作用。在细菌中，主要由磷酸盐特殊转运系统(phosphatespecific transport，Pst)和磷酸盐转运系统(Pi transport，Pit)来完成对无机磷酸盐(inorganic phosphates，Pi)的吸收和利用，其中Pst系统是Pi吸收转运的关键系统。该系统是细菌在低Pi环境下，以高亲和力结合Pi，并将其转运至细胞质内的磷酸盐转运系统。该系统包含3个结构域，分别是底物结合结构域、跨膜结构域和ATP结合结构域。在E.coli等大部分细菌中，Pst系统一般由PstS、PstC、PstA、PstB和PhoU 5个蛋白组成。其中，PstS为外周结合蛋白，是Pst系统中的关键蛋白，该蛋白与Pi具有极高的亲和性，负责感知和结合周质空间的Pi，由pstS基因编码。

目前有报道在大肠杆菌(E.coli)以及蓝藻细菌(Cyanobacteria)等细菌中采用突变等手段获得pstS基因变异株，但尚未见pstS基因缺失或突变的重组溶藻弧菌pstS基因株报道，更未见利用RNAi技术稳定沉默筛选获得溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株，其为Vibrio alginolyticus pstS-RNAi，于2021年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2021764。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株在制备预防和/或治疗哈维氏弧菌病疫苗中的应用。

本发明提供的溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株是通过如下技术手段进行构建：

S1.通过比较转录组学分析技术，将筛选致病功能基因目标锁定pstS基因，qRT-PCR验证pstS基因；

S2.根据目的基因序列设计shRNA并连接到质粒pACYC184上，组成重组质粒pACYC184-shRNA，重组质粒pACYC184-shRNA热激转化导入DN5α感受态中，通过测序验证shRNA是否连接成功。

S3.shRNA连接成功后，重组质粒pACYC184-shRNA导入大肠杆菌SM10感受态中。