[发明专利]基于目标物识别诱导脱氧核酶释放策略检测蛋白质的方法及应用和试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于目标物识别诱导脱氧核酶释放策略检测蛋白质的的方法及应用和试剂盒，方法包括以下步骤：合成第一探针和与脱氧核酶互补的第二探针；向待测溶液中加入第一探针和第二探针，随后将待测溶液置于35‑37℃孵育25‑35min；向孵育结束后的待测溶液中加入发夹，随后测定荧光动力学曲线0.8‑1.2h或置于35‑37℃孵育60‑70min后测定荧光强度，操作简单、无需分离洗涤，能够检测所有的蛋白质，应用范围广；高灵敏度与准确性；在以非治疗为目的的蛋白质检测中具有很大的潜力；具有良好的抗干扰能力，检测结果准确性高。

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种基于目标物识别诱导脱氧核酶释放策略检测蛋白质的方法及应用和试剂盒。

背景技术

酶联免疫吸附测定(ELISA)是检测蛋白质生物标志物的典型方法，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法；但是蛋白质传感需要反复孵育和洗涤，费力且耗时，同时亲和抗体会不可避免地受到生物样品中非特异性蛋白的干扰，从而产生假阳性或阴性信号，信号输出组件也很容易被吸附到微孔板上，从而产生不准确的结果。因此，需要开发用于蛋白质生物标志物的均相生物传感系统。

发明内容

本发明针对现有的酶联免疫吸附测定存在的上述问题，本发明提供基于目标物识别诱导脱氧核酶释放策略检测蛋白质的方法。

本发明采用以下技术方案：基于目标物识别诱导脱氧核酶释放策略检测蛋白质的方法，包括以下步骤：

合成第一探针和与脱氧核酶互补的第二探针，第一探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

向待测溶液中加入第一探针和第二探针，随后将待测溶液置于35-37℃孵育25-35min；

向孵育结束后的待测溶液中加入发夹，随后测定荧光动力学曲线0.8-1.2h或置于35-37℃孵育60-70min后测定荧光强度。

进一步限定，所述第二探针为双链结构，第二探针的一端为蛋白质的识别配体且其另一端与脱氧核酶互补。

进一步限定，所述第一探针为双链结构，第一探针的一端为蛋白质的识别配体且其另一端与第二探针部分碱基互补。

进一步限定，所述发夹的茎一端修饰有荧光基团，且另一端修饰有淬灭基团，环上的部分碱基可以与脱氧核酶的“臂”结合，环中间设置有脱氧核酶的切割位点。

进一步限定，所述脱氧核酶的切割位点上为腺嘌呤核糖核苷酸。

进一步限定，加入第一探针和第二探针后，孵育过程中孵育温度为37℃，孵育时间为30min。

进一步限定，加入发夹后孵育温度为37℃，孵育时间为60min。

进一步限定，测定荧光动力学曲线的时间为1h。

本发明中：1.第一探针和第二探针与目标物结合；2.利用诱导链置换释放脱氧核酶链；3.加入发夹，发夹的茎两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团，环上的部分碱基可以与脱氧核酶的“臂”结合，环中间有一个腺嘌呤核糖核苷酸(rA)，为脱氧核酶的切割位点；4.脱氧核酶切割发夹后释放脱氧核酶；5.脱氧核酶切割发夹后与发夹分离，再次游离于溶液中；6.脱氧核酶再次结合发夹；7.发夹检测，发夹被切割后荧光恢复，因此可通过荧光检测仪器检测到荧光信号，根据信号的强弱判定检测的灵敏度。

本发明的有益效果为：1.操作简单、无需分离洗涤，能够检测所有的蛋白质，应用范围广；2.高灵敏度与准确性，如血小板衍生因子BB(PDGF-BB)的检测范围为100pM-20nM，前列腺特异抗原(PSA)的检测范围为200pM-20nM；在以非治疗为目的的蛋白质检测中具有很大的潜力；3.具有良好的抗干扰能力，检测结果准确性高。