[发明专利]一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法

说明书

本发明提供了一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法。本发明的制备方法包括一步化学法与酶催化法有序进行的步骤：提取大肠杆菌K4多糖，将其化学法脱果糖后，采用硫酸软骨素降解酶降解得到软骨素寡糖混合物；经超滤离心管分离法、Bio‑GelP‑2凝胶排阻层析法和HPLC分离法，制备得到软骨素二糖～八糖；所得到的产物分别进行酶催化4‑O‑硫酸化修饰、6‑O‑硫酸化修饰，分别得到硫酸软骨素CS‑A和CS‑C寡糖。本发明中的原料非动物来源、污染风险低，采用的反应条件温和、高效，且制备得到的硫酸软骨素二糖至八糖结构和分子量确切，为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的研究提供了可能性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)，广泛存在于人和动物软骨组织中的一类酸性粘多糖，属于糖胺聚糖的一种。其结构是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3糖苷键形成二糖单元，重复二糖单元再以β-1，4糖苷键连接形成。CS的糖单元上不同位点被硫酸基团取代，形成不同种类的硫酸软骨素，CS-A、CS-B、CS-C、CS-D、CS-E。CS具有较高的生物活性，如抑制或者促进轴突生长和再生，参与炎症反应，促进成骨等。大量研究表明，CS寡糖与复杂的CS多糖相比，聚合度和结构相对均一，大大地避免了多糖在特殊生物活性中作用机理的模糊性，且分子量小易于吸收，因此我们可以制备结构和分子量可控的寡糖片段来研究其生物活性。

Zhou ZhengXiong等人采用两步生物学策略生产了CS-A和CS-C，首先优化了重组枯草芽孢杆菌对CH的发酵生产，然后通过芳基磺基转移酶IV(ASST IV)、软骨素4-O-硫酸基转移酶(C4ST)、软骨6-O-硫酸基转移酶(C6ST)组合形成的硫酸化转化系统催化发酵产生的CH合成CS-A和CS-C，转化率分别达到98％和96％。但是，无论是直接发酵生产CS，还是间接发酵生产CH后硫酸化为CS，都存在产物纯化和鉴定的瓶颈问题，尚未有利用发酵法生产结构明确CH或CS的相关报道。

申请号201711216846.9已经公开了硫酸软骨素D四糖的制备方法，采用了醇沉、阴离子交换色谱分离、凝胶色谱分离等步骤；申请号201210159448.9已经公开了不同分子量寡糖的制备方法，包括酶解、分子筛、离子交换和制备电泳等手段。以上均是专门对高硫酸化的动物源硫酸软骨素，如硫酸软骨素D或硫酸软骨素E寡糖进行高效率纯化。

目前对非动物源硫酸软骨素特定结构和分子量寡糖的分离制备方法还没有报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法。

一种非动物源硫酸软骨素寡糖，所述非动物源硫酸软骨素寡糖结构式如下所示：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆独立地选自-H或-SO₃H；

x＝0～2的整数，

y＝0或1。

所述的非动物源硫酸软骨素寡糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)使用化学法将K4多糖中的葡萄糖醛酸的3-位β连接的果糖脱去，得到DK4；

(2)将步骤(1)中所得DK4与硫酸软骨素降解酶混合进行降解反应，得到软骨素寡糖混合物；