[发明专利]一种验证白耙齿菌降解杜仲果壳木质纤维素的方法

说明书

本发明公开了一种验证白耙齿菌降解杜仲果壳木质纤维素的方法，包括以下步骤：步骤一：白耙齿菌的采集；步骤二：首先，准确称取300mg步骤一种的固体发酵样品，加入3.0mL浓硫酸(72％)在30℃条件下水解1h；步骤三：用超纯水稀释硫酸至4％，高压反应釜中121℃条件下继续水解1h；步骤四：水解结束后，自然冷却水解液，用事先恒质量的砂芯漏斗过滤，通过称取滤渣的质量计算出酸不溶性(Klason)木质素的含量；步骤五：滤液稀释2倍，用HPLC分析滤液中糖含量，换算出纤维素和半纤维含量。通过Plackett‑Burman Design和Box‑Behnken响应面优化试验，白耙齿菌对杜仲籽果壳的的降解率可达41.87％。验证了耙齿菌的菌株可用于木质纤维素类生物质降解。

技术领域

本发明涉及降解杜仲果壳木质纤维素的技术领域，具体是一种验证白耙齿菌降解杜仲果壳木质纤维素的方法。

背景技术

杜仲(Euocmmia ulmoides Oliv.)为杜仲科杜仲属落叶乔木，为我国特有的单科单属单种植物，也是世界上适应范围最广的重要胶源植物。天然杜仲胶是我国独有的战略资源，国家林业局在《全国杜仲产业发展规划(2016-2030)》中指出，到2030年，建成5000万亩杜仲良种高效栽培产业基地，未来杜仲胶年产量达到120万吨以上，杜仲胶已成为国家战略资源。杜仲的果、叶、皮中都含有丰富的杜仲橡胶，其中果壳含胶率最高，为12％～17％，树皮含胶5％～10％；叶片含胶1％～3％。杜仲翅果的果壳中富含白色丝状杜仲胶，但杜仲果壳中因存在木质纤维素而影响杜仲胶的提取效果。因此，预处理杜仲果壳，改变其木质纤维素的结构及通透性，使胶体能够溶出，对杜仲胶的提取至关重要。传统预处理方法是采用强碱或是强酸破坏果壳细胞壁的结构，会造成提取杜仲胶工艺复杂，胶的质量不高，且环境污染严重等问题。而微生物预处理，可通过分泌胞外酶降解纤维类物质，使杜仲胶暴露在外，且研究表明，用微生物处理杜仲籽果壳并不影响杜仲胶的结构，从而简化提取和提纯杜仲胶的后续工序。因此，大多数科研工作者不约而同将目光集中在对发酵微生物的提取分离、培养条件及对提胶工艺的优化方面。对于发酵过程中木质纤维素的降解机理及结构的改变关注较少，而杜仲果壳中的木质纤维素的降解及结构改变是提取杜仲胶最基础的环节之一。因此，本课题采用从杜仲腐殖层中分离鉴定的白耙齿菌作为目标微生物，探讨微生物预处理过程中纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶活性的变化，以及与纤维素、半纤维素和木质素降解的相关性进行讨论，并进一步对杜仲果壳木质纤维素的结构改变进行研究，以期阐明木质纤维素降解相关机制，为杜仲胶的提取制备提供理论支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种验证白耙齿菌降解杜仲果壳木质纤维素的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种验证白耙齿菌降解杜仲果壳木质纤维素的方法，包括以下步骤：

步骤一：白耙齿菌的采集：从湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市某杜仲籽果壳林地腐殖层分离鉴定的白耙齿菌作为目标微生物进行固体发酵；

步骤二：从步骤一中的固体发酵样品中准确称取300mg样品，加入3.0mL浓硫酸(72％)在30℃条件下水解；

步骤三：用超纯水稀释硫酸至4％，高压反应釜中121℃条件下继续水解；

步骤四：水解结束后，自然冷却水解液，用事先恒质量的砂芯漏斗过滤，通过称取滤渣的质量计算出酸不溶性(Klason)木质素的含量；

步骤五：滤液稀释2倍，用HPLC分析滤液中糖含量，换算出纤维素和半纤维含量。

作为本发明的进一步方案，在步骤一中，前期通过筛选，纯培养了一批从杜仲林腐殖土中分离的真菌。

作为本发明的进一步方案，所述真菌用MA筛选平板在28℃条件下恒温培养7天，按照颜色、形态等形态特征挑取得到26个单一菌落，转接到PDA平板进行纯化培养，直至得到纯培养物。