[发明专利]颗粒纯化方法、单一颗粒分注方法及细胞簇分析方法、以及其使用装置

说明书

本发明的目的之一在于提供一种在短时间内从高浓度的颗粒中纯化目标颗粒的方法或装置。所述技术问题能够通过本发明的颗粒纯化方法来解决，该颗粒纯化方法为纯化目标颗粒的方法，其特征在于，包含从高浓度的非目标颗粒中分选出目标颗粒的工序,且反复进行三次以上所述分选工序。

技术领域

本发明涉及颗粒纯化方法、单一颗粒分注方法及细胞簇分析方法、以及其使用装置。

背景技术

为了检测大量夹杂细胞中的特定的细胞，并进行基因分析等，需要将颗粒逐个分注。本发明涉及一种从总细胞数为10⁸个左右的细胞中纯化数量为100个左右的细胞的方法、以及对该100个左右的细胞进行分注的方法。此外，作为应用例，还包括在癌症患者的血液中流动的循环肿瘤细胞的分取。因此，涉及一种利用实现不同患者间的细胞无污染的一次性替换型芯片的颗粒分取及分注技术。另外，在本说明书中，颗粒包括细胞或包含油中液滴的颗粒等。

对于细胞分选及后续的分注技术的现有技术及其技术问题进行叙述。

(1)现有的Jet-in-Air(在空气中激发)方式细胞分选仪技术

如非专利文献1中所叙述的，其为自喷嘴形成液滴，并以液滴为单位对液滴中所包含的细胞进行分取的Jet-in-Air方式。

(2)基于微流控的细胞分选技术

基于微流控的分选中的分选速度慢至1000个/秒以下左右。然而，专利文献1中记载了利用多个流路以并行处理提高吞吐量(throughput)的技术、及使处理后细胞返回流路中并再次处理从而提高分选纯度的技术。

专利文献2中记载了通过使流控芯片具有多个分选部，并连续实施各个分选部的处理从而提高分选纯度的技术。专利文献3中记载了使用带有池的微流控芯片，从细胞群中分选并去除不需要的细胞，使剩余的细胞再次返回上游的样本池中并进行分选处理的方法。

专利文献3中记载了在具有池的微流控芯片中的基于脉冲流(pulse flow)的分选技术。进一步，专利文献4中记载了在微流控芯片中分选并去除不需要的细胞，从废液池回收剩余的细胞液，并使其返回上游的样本池中，反复进行阴性分选的方法(反复阴性分选法)。

(3)单一细胞分注技术

根据需要，有时会将分选出的细胞以一个细胞为单位分注至多孔板中。就该技术与技术问题进行说明。作为用于筛选夹杂细胞中所包含的目标细胞并将细胞分注于多孔板的方法，非专利文献2中记载了将使用Jet-in-Air方式细胞分选仪分取的液滴，直接分注于多孔板的方法。专利文献5中记载了通过图像识别来识别目标细胞，并作为液滴在压电压力下分注于多孔板的方法。该方法的技术问题在于，在使用了压电压力的情况下，能够喷出的液滴大小是有限的。专利文献6中记载了使用移液管从悬浊液中吸取欲分注的细胞，并对移液管内部进行拍照，在识别到含有一个细胞时进行分注的技术。

(4)乳液液滴的分注技术

单一细胞的分注技术存在如上所述的多种技术。其中，在对油中的乳液颗粒进行分注时，液滴在油中沉降的乳液颗粒能够以与细胞相同的方式进行分注。然而，微滴数字PCR(Droplet digital PCR)或单一细胞表达分析中所利用的氟类油的比重较大。因此，乳液液滴会漂浮在油中，故而难以通过使其自上方落下的方式进行分注。专利文献7中记载了对氟类油中的乳液液滴进行分注的方法。

(5)基于流式细胞术的细胞分析技术

非专利文献3中记载了现有的流式细胞术的技术与分析方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第6976590号说明书

专利文献2：美国专利第8993311号说明书

专利文献3：国际公开2012/067259号

专利文献4：国际公开WO2016/182034号

专利文献5：国际公开2011/154042号