[发明专利]马来甜龙竹转基因体系的建立方法

说明书

本发明公开了一种马来甜龙竹转基因体系的建立方法，采用以下步骤：1）愈伤组织诱导；2）农杆菌培养；3）侵染及共培养；4）脱菌及筛选培养；5）抗性愈伤组织分化及抗性苗生根；6）抗性植株分子鉴定。本发明以马来甜龙竹愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法从472块愈伤组织中成功获得34棵抗性植株，转化率为7.20%，抗性植株均有花青素积累表型，提取其中6棵抗性植株进行RNA提取，并反转录得到其cDNA进行PCR检测，结果证实玉米花青素基因已转入竹子基因组中。本发明转化效率高，步骤简单，周期短，效果显著，对其他竹种的转基因体系建立具有一定的参考作用。

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种马来甜龙竹转基因体系的建立方法，该方法使用马来甜龙竹无菌苗茎段诱导的胚性愈伤组织作为转基因的受体，采用根癌农杆菌介导的转基因方法，经过农杆菌侵染、共培养、筛选培养来获得抗性愈伤组织，经过分化和生根培养后获得抗性植株，再经过分子水平的检测验证转基因并确定植株。

背景技术

马来甜龙竹（Dendrocalamus asper）为牡竹属（Dendrocalamus）大型丛生竹，作为一种重要的经济竹种在东南亚国家，尤其在菲律宾、马来西亚和泰国等地被广泛栽培。在我国香港、台湾和云南，广州和福建亦有引种栽培。马来甜龙竹开花周期长，花期难以预测，结实率低等问题一直阻碍着马来甜龙竹育种研究的进展。而使用现代生物技术，利用植物转基因技术改良马来甜龙竹能有效解决其育种困难的问题。而目前，成功建立竹子转基因研究的报道主要为麻竹，马来甜龙竹的转基因体系尚未有研究报道。

发明内容

本发明通过马来甜龙竹无菌苗腋芽诱导得到的愈伤组织为受体材料，通过农杆菌侵染、共培养和筛选培养后得到抗性愈伤组织。抗性愈伤组织在分化培养基上分化得到抗性植株，通过分子检测确定其为转基因马来甜龙竹，在生根培养基上诱导生根并驯化移栽。此发明提供了一种马来甜龙竹转基因体系的建立方法。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的马来甜龙竹转基因体系的建立方法，采用以下步骤：

1）愈伤组织诱导：选用马来甜龙竹无菌苗腋芽为外植体，于愈伤组织诱导培养基中诱导培养30±2 d后得到愈伤组织，选取乳黄色，质地坚硬的愈伤组织转移至增殖培养基中进行培养，即获得用于马来甜龙竹转基因后续所用的马来甜龙竹胚性愈伤组织；

2）农杆菌培养：挑选含有目的质粒的农杆菌，在含有50 mg·L^-1的卡那霉素（Kan）和50 mg·L^-1利福平（Rif）的YEP固体平板上划板，28℃暗培养1~3 d，即可得到单菌落，挑取单菌落接种于1 mL含有50 mg·L^-1的卡那霉素和50 mg·L^-1利福平的YEP液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5~0.6之间，之后将全部1 mL菌液接种于50 mL含有50mg·L^-1的卡那霉素和50 mg·L^-1的利福平的YEP液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5~0.6之间，OD₆₀₀达到使用标准后向菌液中添加AS至浓度达到200 μM，并继续在28℃，200 rpm的培养条件下振荡培养30 min后用于侵染；

3）侵染及共培养：将马来甜龙竹胚性愈伤组织与菌液混合，振荡15 min后倒去菌液，在无菌滤纸上吸去表面多余菌液，并转移至共培养培养基中，在25±2℃下暗培养4 d；

4）脱菌及筛选培养：共培养4 d后将愈伤组织取出进行脱菌，使用无菌水清洗愈伤组织3~4遍，至清洗后的废液不再混浊为止，再使用含有200 mg·L^-1特美汀（Tim）的无菌水清洗并浸泡3~5 min，脱菌后使用无菌滤纸吸干表面水分，并在超净工作台使用无菌风吹1h，直至愈伤组织表面干燥为止，将吹干后的愈伤组织转移至筛选培养基中，在25±2℃下暗培养的条件下进行筛选培养，每4周继代一次，3次继代后得到抗性愈伤组织；