[发明专利]一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果和毒性作用的方法

说明书

本发明涉及一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果和毒性作用的方法。本发明基于内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼的胚胎，在合适的时机用受试化合物处理胚胎，处理后捕获图像，测量体节血管长度、肠下血管的面积和视网膜血管的面积分析图像，最终确定受试化合物的抗血管生成作用，另外还用受试化合物处理胚胎，观察胚胎的存活数、畸形数、是否出现心包水肿、心率减慢等毒性反应评估受试化合物的毒性。本发明建立了发现抗血管生成药物的临床前功效‑毒性模型，基于该平台探究药物的有效性和安全性具有高通量，评价结果客观、准确、全面的优点。

技术领域

本发明涉及药物筛选和评价领域，具体地说，涉及一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果和毒性作用的方法。

背景技术

血管生成本身由几个生理过程组成：内皮发芽、套叠式血管生成和动脉生成(平滑肌向血管的募集)。肿瘤进展通常取决于血管供应的形成(尽管最近的研究表明血管共同选择是肿瘤发展过程中的另一种生存方法)。新形成的脉管系统提供营养，清除废物，促进肿瘤生长和转移。血管形成的开始由缺氧诱导因子(HIF)控制。HIF-1与血管生成生长因子和葡萄糖代谢相关的靶基因的启动子和增强子内的缺氧反应元件结合。这些包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF-β)、转化生长因子β(TGF-β)、血管生成素(Ang2)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、肾上腺髓质素、表皮生长因子(EGF)和尿激酶型纤溶酶原激活剂。

在肿瘤的治疗过程中，抗血管生成有助于阻止肿瘤的生长和转移，所以肿瘤血管生成，也一直是肿瘤药物发现的重点领域。肿瘤与非肿瘤内皮细胞之间的表型和遗传差异，使得开发抗血管生成剂作为靶向药物成为一种合理的策略，并且，靶向治疗后的不良反应也是有限的。临床上使用和评估的主要抗血管生成剂包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂，如舒尼替尼，凡德替尼，帕唑帕尼，卡博替尼和阿昔替尼；其次是多激酶抑制剂，如索拉非尼，舒尼替尼。也有研究评估了内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(如厄洛替尼)的抗血管生成活性，已知该抑制剂可通过与血管内皮生长因子(VEGF)通路的功能性相互作用来抑制血管生成。

在药物发现中，通常可以通过几种表型筛选来评估血管生成：例如基于体外细胞的方法和体内全生物方法。体外血管生成测定如内皮细胞迁移和管形成作为转化模型的实用性受到其无法模拟体内环境的复杂性和证明异质内皮细胞差异行为的限制，例如Matrigel胶测定，鸡绒膜尿囊膜(CAM)测定或角膜血管生成测定之类的体内动物模型，虽然保持了生物学上的复杂性，但通量低且半定量，需要大量的药物和人员参与用于抗血管生成化合物的筛选。

抗血管生成药物从药物发现到临床应用，淘汰率很高，原因在于药物的治疗窗口狭窄、脱靶现象以及疗效不佳。因此，准确高效的临床前筛选和评估平台将极大地节约抗血管生成药物挖掘所耗费的精力和财力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果的方法，包括以下步骤：

a)将内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼的胚胎于受精后24h时用蛋白酶去绒毛膜；

b)去绒毛的胚胎用含有0.003％苯基-1-硫脲的E3培养液培养；

c)在受精后1d和4d，将胚胎暴露于受试化合物中，并用胚胎培养基和0.1％DMSO分别处理斑马鱼胚胎作为空白对照和媒介物对照；受试化合物处理24h后，麻醉胚胎并捕获其图像，观察体节血管长度来分析图像，以确定受试化合物的抗血管生成作用；