[发明专利]不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一种不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：

1)提取已知不同加工工艺的牛奶的代谢物，作为标准样品；所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；

2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述标准样品的色谱峰；

3)提取所述色谱峰的特征峰信息；

4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为代谢组生物标志物；

所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；

所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述提取不同加工工艺的牛奶的代谢物的方法包括以下步骤：

分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体，所述第一离心的转速为10000～13000g；所述第一离心的时间为10～30min；

将所述下层液体与溶剂混合，涡流后进行第二离心，取上清液，所述溶剂包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种，所述涡流的时间为3～10min，所述第二离心的转速为10000～13000g；所述第二离心的时间为10～30min；

将所述上清液经微孔过滤膜过滤，收集滤液，获得代谢物，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中所述高效液相色谱分离的条件包括：流动相为流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；所述梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min；

正离子模式下：所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；所述洗脱程序为：

负离子模式下：所述流动相A为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺水溶液；所述流动相B为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺乙腈溶液；所述洗脱程序为：

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高分辨质谱的条件包括：模式：数据依赖性采集模式；离子源：电喷雾离子源；数据采集范围m/z为50～1000Da；

正离子模式的采集条件包括：喷雾电压为4500～6000V；去簇电压为20～120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～600℃；碰撞能为35±15eV；

负离子模式的采集条件包括：喷雾电压为-5500～-4000V；去簇电压为-20～-120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～600℃；碰撞能为35±15eV。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中所述特征峰信息包括：峰强度大于100cps且信噪比＞3。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中提取所述色谱峰的特征峰信息包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；

提取的特征峰的参数包括：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa。

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)中对所述特征峰信息进行数据处理包括以下步骤：将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，剩下的缺失值用该代谢物在所有样品中的最小值的一半进行缺失值的填充，同时进行归一化处理，得到预处理数据；将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。