[发明专利]一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因

说明书

本发明公开了一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因，该细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码基因如SEQIDNO.2所示，利用宏基因组分箱技术组装获得一株未培养毛螺菌科NK4A136菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶。该细菌漆酶与真菌来源的漆酶相比，其pH稳定性和温度稳定性更好。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因，通过宏基因组测序分析技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株。

背景技术

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)，又称为酚酶、多酚氧化酶，属于一种多铜氧化酶类，其能够氧化多种芳香族化合物，最终将分子氧还原生成水。所以，漆酶是一类具有重要应用价值的绿色催化剂。

漆酶广泛分布在真菌、细菌、昆虫和动植物体内。对比动植物来源漆酶，微生物漆酶来源更加丰富。真菌来源漆酶在pH 4～6和30～55℃条件下有较高活性，而工业应用往往需要高温和强碱环境，使漆酶的应用受限且成本较高。而且真菌生长周期长对培养基要求苛刻，使得发酵罐易受到机械损伤，这些问题导致真菌漆酶在工业上的应用受到严重影响。而细菌漆酶不需要糖基化修饰，通常以单体蛋白体形式存在，pH适用范围广、热稳定好且存在Cu²⁺抗性等。这些对漆酶更广泛的应用具有重要意义。目前，对于细菌漆酶基因资源的挖掘较少，有待进一步发掘高活性高稳定性的新型细菌漆酶。

随着第二代测序技术的发展，结合宏基因组学分析手段，在挖掘微生物功能酶基因方面，能够成功的避开传统的微生物纯培养技术难题，且能够快速在短时间内发现大量功能酶基因，提高了功能酶基因

筛选的广泛性和有效性，大大促进了功能酶基因克隆效率的提高，为寻找和发现新型漆酶基因提供了新的研究策略。

发明内容

本发明的目的在于克服和避免漆酶在工业生产应用中不足之处，并提供一种来源于亚洲象肠道未培养毛螺菌科新型细菌漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。

本发明中，新型漆酶的编码基因来源于亚洲象肠道微生物宏基因组，应用分箱(Binning)技术组装获得一株未培养毛螺菌科NK4A136菌属细菌的基因组(完整度为96.44％，污染率为0)，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，该漆酶基因的氨基酸序列与NR数据库的现有漆酶氨基酸序列比对最高一致性约为52％。对该新型漆酶编码基因进行克隆，并在枯草芽孢杆菌表达系统进行表达，获得了枯草芽孢杆菌高稳定性漆酶重组菌株。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶，所述细菌漆酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

所述细菌漆酶以底物2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)测定新型漆酶酶学性质时，最佳作用温度为70℃，最适作用pH为5。

以底物ABTS测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果显示：在60℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，作为来源于亚洲象肠道未培养毛螺菌科细菌的新型漆酶，其pH稳定性和热稳定性比真菌来源的漆酶更好。

所述细菌漆酶的编码基因也在本发明的保护范围制备，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的另一方面，将上述细菌漆酶的编码基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。提供了一种包含所述编码基因的重组载体。

作为本发明的一个优选的实施方案，将上述细菌漆酶的编码基因和表达载体pBE-S相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pBE-S-Laac2。