[发明专利]一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因

说明书

本发明公开了一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因，该细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码基因如SEQIDNO.2所示，利用宏基因组分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶Lacc1。该该细菌漆酶与真菌来源的漆酶相比，具有良好的热稳定性和pH稳定性。

技术领域

本发明属于酶基因工程技术领域，涉及一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因，通过宏基因组测序分析技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)属于多铜氧化酶类，其能够催化多种类型的酚类及非酚类化合物的氧化，并且以分子氧作为电子受体，最终生成水，不会生成其他有害的副产物，是一类绿色、环保、环境友好的生物催化剂。漆酶已经广泛应用在制浆造纸、药物合成、污水处理、食品能源等领域。

漆酶分布广泛，目前在细菌、真菌和动植物等体内都被发现过。对比动植物来源漆酶，微生物漆酶来源更加丰富。但是，真菌来源漆酶在工业生产中遇到极端环境如高温和碱性条件下其活性很难保持，其应用受限。细菌来源漆酶底物广泛、pH稳定性和热稳定性强、以及耐受碱性环境等特点引起了研究人员的普遍关注。

细菌漆酶基因的获得、克隆和表达，首先要通过传统的微生物纯培养技术进行菌株的分离和纯化，但99％以上的不可培养微生物是无法分离获得的，尤其是肠道环境的厌氧微生物可培养性更低，因此通过分离培养细菌筛选新型漆酶的传统方法限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学结合高通测序技术避开了微生物分离培养问题，能在短时间内发现大量功能酶基因，提高了酶功能基因的克隆效率，为寻找和发现新的漆酶基因提供了新的研究策略。

发明内容

本发明的目的在于克服和避免漆酶在工业生产中不足，并提供一种来源于亚洲象肠道宏基因组细菌的新型漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。

本发明中，新型漆酶的编码基因来源于亚洲象肠道宏基因组，经分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，对该新型漆酶编码基因进行克隆，并在大肠杆菌表达系统进行表达，获得了大肠杆菌高稳定性漆酶重组菌株。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶Lacc1，所述细菌漆酶Lacc1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述细菌漆酶Lacc1以底物2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)测定新型漆酶Lacc1酶学性质时，最佳作用温度为75℃，最适作用pH为5.5。

以底物ABTS测定该新型漆酶Lacc1的pH稳定性和热稳定性，结果显示：在70℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，作为鲜有报道的亚洲象肠道宏基因组来源的新型漆酶Lacc1，与真菌来源的漆酶相比，其pH稳定性和温度稳定性更好。

所述细菌漆酶的编码基因lacc1也在本发明的保护范围制备，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的另一方面，将本发明的细菌漆酶编码基因lacc1插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。提供了一种包含所述细菌漆酶基因lacc1的重组载体。

作为本发明的一个优选的实施方案，将本发明的细菌漆酶编码基因lacc1和表达载体pET28a(+)相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pET28a-laac1。