[发明专利]用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法

说明书

本发明公开了一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下几个步骤：步骤一，在微型离心管中，加入0.3～0.5 mm无菌石英砂至管总体积的1/20，挑取1～3 mm²真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入几丁质酶溶液，捣碎，37℃孵育30分钟；步骤二，加入细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；步骤三，加入磁珠，对核酸‑磁珠复合物进行纯化和洗脱，获得高纯度的DNA。本发明克服了提取试剂盒对样本量的要求，解决了丝状真菌破壁困难，DNA提取中PCR抑制因子存在导致的PCR假阴性等技术问题，实现了微量丝状真菌DNA的快速高质量低成本制备。

技术领域

本发明涉及核酸提取工艺的领域，尤其涉及一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法的技术领域。

背景技术

在真菌分子生物学鉴定中，DNA模板在PCR扩增反应中起着至关重要的作用，高纯度的DNA可以减弱或消除导致PCR假阴性的PCR抑制因子。真菌的DNA提取过程中，一定程度有效地破坏真菌细胞壁是获取核酸的关键，而丝状真菌相比酵母菌，其细胞壁成分更为复杂，主要由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白等组成，更难被破坏。现有的真菌高纯度的核酸提取常采用试剂盒提取法，市场上常见的包括QIAGEN 12888 土壤DNA提取试剂盒、Biospin 真菌基因组DNA提取试剂盒、天根植物提取试剂盒等。针对菌落小或微量的丝状真菌样本，采用试剂盒提取法很难获得PCR扩增反应所需的核酸量，而且操作中还需使用球磨仪、高速离心机等仪器，提取成本也相对较高。

发明内容

为了克服现有技术的不足, 本发明的目的是提供一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，不采用试剂盒提取法，实现微量丝状真菌DNA的快速高质量低成本制备。

一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下步骤：

步骤一，在200 μL离心管中，加入尺寸为0.3～0.5 mm的石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取1 mm²真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；

步骤二，加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；

步骤三，加入Beckman的XP纳米磁珠，形成核酸-磁珠复合物，在磁力架上移除上清液，加入洗涤液对核酸-磁珠复合物进行洗涤；移除磁力架，加入洗脱液对核酸-磁珠复合物进行洗脱，获得高纯度的DNA。

所述石英砂尺寸为0.3～0.5 mm，经121℃高温及灭菌处理30分钟。

所述几丁质酶来源于链球菌属真菌，其溶液浓度为1 mg/mL；

所述细胞裂解液，含Triton X-100 5.0%～10.0%，Tween 20 1.0%～5.0%，40 mM～100 mM Tris-HCl，pH 6.0。

所述洗涤液为75%～85%乙醇。

所述洗脱液为TE缓冲液，含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， pH=8.0。

本发明的有益效果：本发明采用细胞壁酶解、蛋白等变性、磁珠纯化等步骤，专一性地解决丝状真菌破壁困难，去除丝状真菌样本中的杂质及PCR抑制因子等技术问题。该制备方法具有操作简单，试剂简单易得，样本量要求低，制备成本低的优点。

附图说明

图1是微量丝状真菌提取过程中不同阶段核酸作为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

其中，1、100 bp Marker；2、 EG1-1裂解后的上清液；3、 EG1-2裂解后的上清液；4、EG2-1裂解后的上清液；5、 EG2-2裂解后的上清液；6、 CGN1-1裂解后的上清液；7、 CGN1-2裂解后的上清液；8、 CGN2-1裂解后的上清液；9、 CGN2-2裂解后的上清液。