[发明专利]一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用

说明书

本发明公开了一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8‑G45R及其应用，所述酯酶突变体Est8‑G45R氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该酯酶突变体Est8‑G45R和野生酯酶Est8相比，对功能底物7‑氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性从2.6U/mg提高到8.53U/mg。本发明在医药领域中对合成新型头孢菌素类抗生素中间体脱乙酰化7‑氨基头孢烷酸具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用。

背景技术

头孢菌素类抗生素属于β-内酰胺类广谱抗生素，能够通过抑制细菌细胞壁的形成、增强细菌细胞膜的通透性、干扰细菌蛋白的合成以及抑制细菌核酸的复制转录来抑制细菌的生长。随着经济的发展，头孢菌素类抗生素在医学和临床上的应用越来越广泛，对合成头孢菌素类抗生素的重要中间体7-ACA(7-amino-cephalsporanic acid,7-ACA)的需求量也日益增加。但是随着抗生素的滥用，细菌出现了耐药性，新型抗生素的开发成为一种趋势。D-7-ACA(Deacetyl-7-amino-cepha losporic acid,D-7-ACA)作为一种合成头孢菌素类抗生素的新型中间体可以由7-ACA脱去3-位上的乙酰基获得。传统合成D-7-ACA的方法为化学裂解法，但存在成本高、工艺流程繁琐和环境污染等问题。新型酶法具有底物专一性，操作简便和对环境友好等优点，对生产D-7-ACA具有良好的发展前景。

酯酶是一类能够催化酯键水解、酯合成和酯交换的酶。GDSL家族酯酶是指在蛋白的N-端具有保守的GDSL序列能够水解硫酯、芳基酯、磷脂和氨基酸等多种底物的一类水解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中。因为细菌是单细胞生物，所以细菌来源的酯酶所处位置环境复杂很难确定其真正底物，再加上进化选择压力就难以确定某种酶的真正生理功能。

申请人前期已经获得微生物来源能够水解7-ACA中酯键生成脱乙酰化的7-ACA(D-7-ACA)的GDSL家族酯酶Est8，其生成的D-7-ACA能够为头孢菌素类抗生素的合成提供新型的中间体，但是该酶催化7-ACA生成D-7-ACA的活性较低。

发明内容

本发明针对上述存在对头孢菌素类抗生素新型中间体的迫切需求的问题，旨在提供一种GDSL家族酯酶乙酰化活性改良突变体Est8-G45R及其应用。

为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术手段：

一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R，所述酯酶突变体Est8-G45R由嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)酯酶基因经定向进化获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本申请酯酶突变体Est8-G45R和野生酯酶Est8相比，对功能底物7-氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性从2.6U/mg提高至8.53U/mg。

其中野生酯酶Est8的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一方面，提供了所述酯酶突变体Est8-G45R的编码基因，所示编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明另一方面，所述酯酶突变体Est8-G45R通过以下方案制备得到：

1)将如SEQ ID NO.2所示基因与表达载体pEASY-E2相连接，将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得重组菌；

2)发酵培养重组菌株，诱导重组酯酶突变体Est8-G45R表达；

3)回收纯化所表达的酯酶突变体Est8-G45R；

4)脱乙酰化活性的测定。