[发明专利]野生四合木愈伤组织诱导方法

说明书

本发明公开了一种野生四合木愈伤组织诱导培养基，包括1/2MS盐、MES、吲哚丁酸IBA、蔗糖、琼脂，所述1/2MS盐、MES、吲哚丁酸IBA、蔗糖、琼脂在培养基中的终浓度为2.3g/l、0.25g/l、3mg/l、10g/l和7g/l，并加入KOH调节pH到5.75‑5.85。本发明还公开了一种野生四合木愈伤组织诱导培养方法，以四合木幼枝为外植体材料，75％酒精消毒1分钟、10％的次氯酸钠溶液处理16分钟，再通过30％的过氧化氢溶液处理10分钟，之后转后培养基中，在16h光照/8h黑暗的培养条件下，1/2MS+3mg/L IBA诱导四合木外植体愈伤；通过以上消毒方式进行愈伤消毒和以上培养基愈伤培养，可以得到理想的愈伤组织，能够为挽救四合木等类似濒危物种提供一定的帮助。

技术领域

本发明涉及四合木愈伤组织诱导培养基及诱导方法，属于植物培养领域。

背景技术

四合木（Tetraena mongolica Maxim）是蒺藜科（Zygophyllaceae）四合木属的一种强旱生肉质叶矮小灌木。根据研究，四合木源于蒙古南大陆热带地区，距今7000万年第三纪以前的残遗植物，现在已经濒临灭绝，被称为植物界的“大熊猫”。目前，野生四合木仅存在于我国内蒙古自治区鄂尔多斯高原西北部，库布其沙漠以南、卓资山的山麓地带，少量延伸到相邻的乌达低山残丘区。四合木的根系发达，可以很好的进行防风固沙，减少水土流失，所以四合木在荒漠植物中地位重要。由于四合木长期在严酷、恶劣自然生境中繁衍进化，有着如耐干旱、耐贫瘠等许多特殊的抗逆基因，因此四合木有着极大的科研价值。

沙漠环境恶劣，生长的植物种类并不多。四合木枝条的含油量很高，易燃烧，因此在当地成为了良好的木柴和牲畜饲料，曾经被人类大规模的砍伐。之后，由于城市建设，四合木和其他的荒漠植物的生存环境受到了极大的影响。目前，四合木被列为国家二级和内蒙古一级珍稀濒危植物。

研究植物的繁育技术是保护珍稀濒危植物的重要内容之一。无性繁殖技术，具有保持母株原有优良特性、提早开花结实和简单易行、成本低等优点，对于保护四合木提供了有效的方法。目前，在四合木的无性繁殖方面，相关实验报道相对很少。

植物进行无性繁殖时的生根方式有多种，扈顺、周志刚等人利用扦插实验发现四合木的生根方式为愈伤组织生根。这种生根方式中，需要先诱导生成愈伤组织后再生成不定根。只有生根，四合木才能在土壤中生存。扦插时幼枝上带有叶片能大幅度提高根的生成，适量添加外源激素也会促进不定根的生成。

李天然等以四合木的茎尖、花芽为材料，在添加了0.5mg /L的2,4-D、0.1 mg/L6-BA、500 mg/L的水解酪蛋白、3%蔗糖的1/2MS培养基诱导出愈伤组织。何丽君等在他的基础上对四合木的种子进行消毒培养出四合木的无菌苗。以其外植体进行离体培养，表明胚状体的发生2,4-D和6-BA是不可缺少的。

植物组织培养过程中的染菌是制约组培育苗发展的主要因素，对于实验和生产都有极大的影响。如果出现无菌操作不严格，无菌室杂菌含量过高，植株幼苗及外植体表面不完全消毒，培养瓶、接种工具灭菌时间短，消毒剂浓度低或放置时间过长，导致部分失效，接种人员自身的消毒不严等诸多情况，随着时间的延长，均有造成培养基的污染的可能性。当组培瓶内感染杂菌后，常会出现不同形状，色彩和大小的杂菌落。随着菌落的不断生长，杂菌在生长中会分泌的次生代谢产物及色素，使得培养基部分染色，同时，杂菌还会分泌毒素影响或杀死植物材料，造成严重的后果。

虽然组织培养的材料用无菌苗的效果最好，但是在实际实验和日常生产中，由于一些特殊环境或者种子稀少等原因，也经常会使用野外材料。而野外植物表面，经常会携带大量微生物，需要把材料表面和组织内的各种微生物杀灭干净而达到不影响外植体组织活力的。这对于植物外植体的消毒造成了极大的困难。

在利用野生植物作为外植体进行组培的试验中，佘小涵利用70%的酒精溶液和0.1%的HgCl溶液对野外直杆蓝桉茎段进行消毒，构建出植物快繁体系。但由于在本实验期间，升汞被列为禁药，所以不能用升汞消毒。