[发明专利]一种禾本科植物的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种禾本科植物的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)将禾本科植物种子萌发、长出第一张叶片后，拔出第一张叶片，此时叶鞘内形成一个杯状结构；(2)向步骤(1)杯状结构中加入具有用于基因编辑的重组载体的根癌农杆菌菌液；(3)继续培养，得到至少部分细胞被基因编辑的转基因植株。本发明基因编辑方法利用禾本科作物幼苗期解剖结构特征，直接在幼苗时期处理顶端分生组织的遗传转化技术，该技术可以省略组织培养过程，成本低、转化效率高。在苗期活体(营养体)上，利用禾本科作物解剖结构的特点，直接用农杆菌菌液感染植物顶端分生组织(SAM)、不需要经过组培阶段、不依赖基因型的遗传转化技术。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及一种禾本科植物的遗传转化方法。

背景技术

植物遗传转化是现代科学中的一项重要技术进步，不仅促进人类对植物生理与发育过程的认知，而且开创了作物遗传改良的新纪元。然而对于许多农作物而言，有效的转化和再生仍然是一个很大的挑战。

现有技术中，植物遗传转化的方法主要有如下几种：(1)基于农杆菌介导的植物遗传转化技术，(2)基于基因枪质粒轰击介导的植物遗传转化技术，(3)基于生物活性珠(藻酸钙珠)介导的植物遗传转化，(4)基于花粉及花粉生长通道介导的植物遗传转化，(5)基于碳化硅丝介导的植物转化技术，(6)基于电击穿孔介导的植物遗传转化，(7)基于显微注射介导的植物遗传转化技术，(8)基于调控顶端分生组织发育的遗传转化方法。

CRISPR-Cas系统是在原核细菌和古细菌中进化产生的RNA引导的适应性免疫反应，用以抵御诸如病毒、转座子和质粒之类的外来遗传因素的侵害。目前CRISPR/Cas9介导的基因组编辑已经在多个模式植物以及水稻、烟草、小麦、大麦、双色高粱、玉米、玉米、茄子、马铃薯、油菜、大豆、莴苣、黄瓜、柑橘、毛白杨、金银花等物种上取得成功，然而CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术也要依赖后续包括组织培养在内的遗传转化技术，而组织培养对于许多物种而言，难度极大。

总而言之，无论是DNA重组还是基因编辑技术，都迫切需要简便、实用、高效率、低成本的遗传转化技术。随着合成生物学的快速发展，用于精确基因组编辑和基因整合的新型载体系统的研发，有可能带来作物遗传改良革命性的进步，为农业的可持续发展展示了美好的前景。因此，不依赖物种(或基因型)的、高效植物遗传转化技术将是下一阶段作物遗传改良的主攻方向之一。

植物遗传转化是应用重组DNA技术或者基因编辑技术，通过细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中/或对受体基因组进行定点编辑，经过减数分裂获得基因组受到修饰之后的新植株的技术。无论是基于CRISPR/Cas9或其它核酸酶的基因编辑技术，还是基于DNA重组的转基因技术，植物遗传转化(transformation)都是达到基因编辑或者转基因目的不可或缺的关键步骤之一。

对于水稻、玉米、小麦、大麦等禾本科粮食作物的遗传转化实践，目前通行的技术是通过农杆菌感染(或者用基因枪DNA质粒轰击)胚、下胚轴、子叶外植体、顶端分生组织等分生能力强的组织，然后通过对愈伤组织的培养来获得(转基因或者受到基因编辑)再生苗。目前的方法具有以下的局限性：(1)组培技术高度依赖物种与基因型，水稻中的籼稻亚种、大麦与小麦的转化效率都非常低；(2)组培过程对环境洁净度的要求非常苛刻，培养基的配置、植物组织的前处理、暗培养/光培养、培养器皿的更换等环节，稍有不慎就会受到污染；(3)组培空间的建设成本和维护成本均较高，能耗较高；(4)组培过程比较耗时间，经过组培得到成苗并开花结籽，比正常种子萌发到开花结籽时间上长3-6个月。

发明内容

本申请针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种新的植物遗传转化技术，克服禾本科粮食作物(水稻、玉米、小麦、大麦等)等四种作物遗传转化技术难度大(转化效率低)、周期长、且依赖物种种类与基因型缺点，省去遗传转化过程中的组织培养步骤，创建一种简单易操作、不依赖基因型、低成本、高效率的禾本科作物遗传转化方法。