[发明专利]一种南方根结线虫卵粒的分离方法

说明书

本发明公开了一种南方根结线虫卵粒的分离方法，本发明的方法将植物根系表面剥离的南方根结线虫卵块进行静止孵育、NaClO离解、震荡、离心、清洗等处理，可以分离出纯净的南方根结线虫卵粒，同时保证了较高的卵活性，具有推广应用的价值。

技术领域

本发明涉及农业植物保护领域，尤其涉及一种南方根结线虫卵粒的分离方法。

背景技术

南方根结线虫Meloidogyne incognita可专性寄生于植物根系，在影响根组织正常形态建成，破坏营养和水分吸收代谢的同时，可导致植物营养和生殖生长的抑制，如植株矮小、叶片黄花萎蔫，坐果率降低等。南方根结线虫，因其生活周期短，寄主范围广，环境适应性强，以及联合植物病原细菌真菌复合发病等特点，每年在我国蔬菜产业发展上引起的经济损失高达500亿人民币。而更重要的是，伴随我国蔬菜和果树产业规模化和集约化转型升级，全球气候生态环境的改变，以及人为因素在生物种群传播中的作用凸显，使南方根结线虫病害成为威胁我国农林产业增效、增质和增产，农民实际增收和社会稳定的最核心因素之一。

南方根结线虫卵粒孵化后得到的二龄幼虫(Second stage juveniles,J2)是该线虫唯一的侵染性虫态，于是，在涉及南方根结线虫分子生态、化学生理、种群多样性与分布、以及发生规律与生态防控等研究领域，虫卵是一类非常重要的线虫虫态。南方根结线虫卵粒和其他根结线虫卵粒类似，在植物根系表面主要以胶质包被的卵块形式存在，而如何从南方根结线虫卵块中高效获取纯净且较高活力的卵粒，并以之为材料，开展线虫发育和分子生理研究，是决定实验可行性的关键。

根结线虫的分离方法较多，有贝曼漏斗分离法、浅盘法分离法、漂浮-过筛分离法、蔗糖分离法及半自动淘洗器法等，这些方法各有优缺点，且以分离活体(混合)线虫种群为主要目的，而对于卵粒的分离，都不能很好的实现。对于直接解剖法、粉碎筛选法和高浓度次氯酸钠消解法，其虽能分离到少量的线虫卵粒，但获取的卵粒在纯度以及活力方面受到显著影响，于是均不利于线虫卵粒的生物学特性研究。

发明内容

本发明的目的在于为了解决上述问题而提供一种南方根结线虫卵粒的分离方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括以下步骤：

①采集南方根结线虫侵染的植物病根，实验室条件下将其保湿放置；

②将植物根组织彻底冲洗，在体视镜下，用镊子挑取足量的线虫卵块，并将其置于含有无菌水中的离心管中；

③将含有线虫卵块的离心管进行旋转离心，用移液器充分移除上清液；

④加入次氯酸钠溶液处理线虫卵块，期间将样品在涡旋震荡器上反复震荡；

⑤将样品旋转离心，后用移液器弃上清；

⑥加入无菌水，涡旋震荡，将样品充分混匀，旋转离心，弃上清；

⑦重复步骤⑥，用无菌水将离解的线虫卵块样品充分洗涤3-5遍；

⑧加入无菌水，将样品充分混匀后于实验台上静置15-30秒；

⑨用移液器吸取离心管上层的线虫卵粒悬浮液，并将其转移到新的离心管中；

⑩体视镜下对线虫卵粒进行计数，并计算其对应的浓度；同时根据实验需求，取相应体积的卵粒悬浮液进行各类条件处理和孵化实验。

优选的，所述步骤②和步骤③的离心管均为1.5mL离心管。

优选的，所述步骤③和步骤⑤的旋转离心转速均为1600rpm，离心时间均为2分钟。

优选的，所述步骤④的次氯酸钠溶液为1mL且有效浓度仅为0.3％。

优选的，所述步骤①的保湿放置时间为48h～72h。