[发明专利]一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法。其中，采用靶序列为小鼠第8号染色体第122502249～122502271个碱基的sgRNA；该sgRNA可用于特异性识别Piezo1基因、敲除Piezo1基因、构建Piezo1基因敲除的细胞系、制备用于构建Piezo1基因敲除的细胞系的产品、构建Piezo1基因敲除的动物模型、制备用于构建Piezo1基因敲除的动物模型的产品，尤其在构建Piezo1基因敲除的细胞系时，相对传统文献报道的shRNA干扰方法，该sgRNA可以从基因组层面对靶基因Piezo1表达进行调控，显著提高Piezo1基因的抑制效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法。

背景技术

高血压病是最常见的心血管疾病诱因，其发病率和死亡率在全球范围内呈上升的趋势。肾素(Renin)是由肾小球旁器(Juxtaglomerular apparatus)分泌的一种天冬氨酸蛋白酶，主要生理作用是将肾素原分解为血管紧张素Ⅰ，Renin是肾素-血管紧张素(RAAS)轴中的关键限速酶。既往的大量研究证实RAAS系统过度激活与高血压的发生有密切的关系，因此Renin的合成与分泌对机体血压调控有重要作用，是重要的抗高血压药物靶点。

研究表明球旁细胞合成及分泌Renin的过程是通过入球小动脉血流压力调控。血压下降触发肾素的分泌，进一步导致血管紧张素Ⅱ引起的血压升高，反之，血压升高会抑制肾素的分泌。传入小动脉血压与肾素分泌之间的反向关系构成一个负反馈，调控机体血压的稳定。然而到目前为止，肾小球旁细胞如何感受血流压力以及其具体的作用机制依然不清楚。Piezo1作为一种新型的机械敏感性离子通道蛋白，在细胞感受机械应力过程中发挥重要作用。研究Piezo1在球旁细胞中的表达及调控Renin合成作用及相关机制进行研究，对调控球旁细胞Renin合成有重要的意义，为高血压疾病治疗及抗高血压药物开发提供新的策略。为达到此目的，首先考虑是建立一株稳定干扰Piezo1表达的细胞株，这样才能更好的对其下游表达及功能进行研究。目前用于体外实验针对Piezo1功能的方法，例如干预其基因表达，多采用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)、短发夹RNA(Short hairpinRNA,shRNA)，或者采用Piezo1抑制剂的方法。

siRNA是一种长度约20～25个核苷酸的双链RNA，其干扰靶基因表达需要Dicer酶和RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)等参与。shRNA包括两个短反向重复序列，将其克隆到shRNA表达载体中，通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA可以被导入靶细胞的细胞核内，shRNA通过细胞内一系列加工形成在两个3’末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到RISC上，从而发挥干扰作用。但siRNA以及shRNA干扰技术对基因表达的调控是在转录层面实现，其主要缺点是干扰效率低，干扰持续时间有限，干扰效果不稳定等。

此外，Piezo1的抑制剂也是干扰其功能的途径之一。目前常用的Piezo1抑制剂有Dooku1，钌红(Ruthenium Red,RR),GsMTx4，Gd³⁺等。其中Dooku1是目前发现的唯一具有选择性的Piezo通道抑制剂，除此之外其余抑制剂都会对除Piezo外的其他离子通道产生影响。如RR同时对TRPV和Piezo通道有抑制作用，GsMTx4对Piezo和TRPC类型的离子通道同时有抑制作用，而Gd³⁺则是一种非选择性的钙离子通道抑制剂。因此，使用抑制剂进行Piezo1的干扰实验显然具有不可避免的缺陷，从而限制了其使用。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种sgRNA。

本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的sgRNA的核酸分子。