[发明专利]稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株及其构建方法、应用

说明书

本公开提供了稳定表达AQP4‑M23蛋白的细胞株及其构建方法、应用，该细胞株为转染了AQP4‑M23基因的293T细胞，命名为AQP4‑M23‑293T，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21019。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株及其构建方法、应用。

背景技术

视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)谱系疾病(Neuromyelitis opticaspectrum disorders，NMOSD)是一种中枢神经系统(Central nervous system，CNS)自身反应性炎性脱髓鞘疾病，主要累及脊髓和视神经，还可累及脑实质。研究表明，NMO的主要病理特征为水通道蛋白-4(Aquaporin4，AQP4)自身抗体(AQP4-immunoglobulin G，AQP4-IgG，或称NMO-IgG)结合星形胶质细胞表面的AQP4后，激活补体，导致一系列炎症反应，造成星形胶质细胞丢失、少突神经胶质细胞受损和神经元死亡。

为支持血清中AQP4抗体的检测，有必要提供一种稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株。

发明内容

本发明提供了稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株及其构建方法、应用。

第一方面，本发明提供了稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株，为转染了AQP4-M23基因的293T细胞，命名为AQP4-M23-293T，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21019。

第二方面，本发明提供了稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株的构建方法，包括：

(1)构建过表达载体

利用根据AQP4-M23序列设计的PCR扩增引物，经PCR扩增得到AQP4-M23扩增产物；

利用与PCR扩增引物包括的两个酶切位点相对应的限制性内切酶，分别酶切AQP4-M23扩增产物及慢病毒载体；

利用DNA连接酶连接AQP4-M23扩增产物的酶切产物和慢病毒载体的酶切产物，获得过表达载体；

利用过表达载体转化感受态细胞；

用过表达载体所含抗性对应的抗生素筛选转化后的感受态细胞，对筛选出的单菌落进行PCR扩增，取阳性菌落摇菌扩增并提取过表达载体的质粒，提取的质粒送去测序进行鉴定；

(2)转染细胞包装慢病毒并浓缩

利用通过测序鉴定的过表达载体与慢病毒包装载体按照一定比例转染细胞，在细胞内包装成慢病毒，同时设置带荧光标记的空载体作为对照，定时回收分泌到培养液中的慢病毒并进行浓缩；

(3)慢病毒转导细胞

利用浓缩的慢病毒转导细胞，通过持续观察对照组细胞荧光发光情况，来评估细胞转导情况；

(4)筛选稳转细胞株

细胞转导情况评估通过后，利用过表达载体所含抗性对应的抗生素对转导后的细胞进行筛选，获得稳定表达AQP4-M23蛋白的细胞株。

可选地，PCR扩增的反应体系中，引物浓度为100-1000nM，DNA聚合酶用量为0.5-2.0U，PCR反应缓冲液为2*，dNTP浓度为100-500μM，模板DNA用量为10-200ng；扩增反应体系体积为20-50μL。

可选地，PCR扩增的反应程序包括：94-98℃预变性2-10min；94-98℃变性10-90s，58-68℃退火10-90s，68-72℃延伸30-300s，共25-40个循环；68-72℃终延伸5-20min。