[发明专利]应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法

权利要求书

1.一种应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：含有极性脂的总脂质物的提取步骤，极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤以及对极性脂富集物复溶后进行超临界流体色谱-质谱检测分析的步骤；

所述含有极性脂的总脂质物的提取步骤包括：

向乳液体原料中加入有机溶剂A后震荡混匀，再加入有机溶剂B后震荡混匀，然后冰水浴超声5~20分钟，再加入溶液C震荡混匀促进分层，得到混合物Ⅰ；

将所得的混合物Ⅰ经离心机离心，移取下层有机溶液，并向上层溶液中加入有机溶剂D进行二次提取净化，再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用溶液C洗涤，震荡混匀再经离心机离心后，弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物；

其中，所述有机溶剂A为甲醇，所述乳液体原料与所述有机溶剂A的体积比为1:10~6:10；

所述有机溶剂B为氯仿，所述乳液体原料与所述有机溶剂B的体积比为1:20~6:20；

所述溶液C为氯化钠溶液，质量百分浓度为0.5%~20%，所述乳液体原料与促进分层的溶液C的体积比为1:1~1:2，所述乳液体原料与用于洗涤的溶液C的体积比为9:1~18:1；

所述有机溶剂D为氯仿和甲醇的混合液，按氯仿：甲醇的体积比为：12:1~1:1；所述乳液体原料与所述有机溶剂D的体积比为1:10~6:10；

所述极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤包括：

先对固相萃取柱进行活化处理，固相萃取柱填料为硅胶1 g/6 mL，使用正己烷进行活化；

将所述含有极性脂的总脂质提取物溶解于有机溶剂E后得到上样液，加载到活化的固相萃取柱上；

先后用有机溶剂F和有机溶剂G洗脱柱体，得到含有甘油三酯的中性脂洗脱液；

先后用有机溶剂H、有机溶剂I和有机溶剂J洗脱柱体，得到富含极性脂的洗脱液，并用氮气吹干得到极性脂富集物；

其中，所述有机溶剂E为氯仿：甲醇按体积比为1:1~8:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂E的质量体积比为30 mg:1 mL~100 mg:1 mL；

所述有机溶剂F为正己烷：乙醚按体积比为100:1~5:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂F的质量体积比为5 mg:1 mL~25 mg:1 mL；

所述有机溶剂G为正己烷：乙醚按体积比为10:1~2:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂G的质量体积比为10 mg:1 mL~50 mg:1 mL；

所述有机溶剂H为正己烷：乙醚按体积比为3:1~0.5:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂H的质量体积比为30 mg:1 mL~90 mg:1 mL；

所述有机溶剂I为甲醇，所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂I的质量体积比为5 mg:1 mL~25 mg:1 mL；

所述有机溶剂J为氯仿：甲醇：水按体积比为3:5:2的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂J的质量体积比为10 mg:1 mL~50 mg:1 mL；

对极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析的条件如下：

超临界流体色谱采用Waters Acquity超高效合相色谱仪UPC²，色谱柱为Acquity UPC²BEH，150 mm × 3.0 mm，1.7 μm，Waters，USA；柱温为55 ºC，背压1500 psi，进样体积2 μL；洗脱液a为超临界CO₂，洗脱液b为含有甲酸铵的甲醇/水溶液，甲醇体积百分比为90%~100%，甲酸铵的含量为5 mM~35 mM，洗脱梯度为0 min, 5% b; 5.5 min, 48% b; 10 min, 48%b；

质谱采用Waters Synapt Q-TOF-MS 质谱仪，碰撞气体流速为50 L/h，去溶剂化气体流速为700 L/h，离子源温度100 ºC，脱溶剂温度400 ºC，锥孔电压 30 eV，低能量碰撞设为 6eV，高能量碰撞设为20~45 eV，质荷比扫描范围为100~1600 m/z；

其中，所述极性脂包含：胆固醇、神经酰胺Cer、磷脂酰甘油PG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰肌醇PI、溶血磷脂酰乙醇胺LPE、磷脂酸PA、单唾液酸神经节苷酯GM₃、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰胆碱PC、双唾液酸神经节苷酯GD₃、神经鞘磷脂SM、溶血磷脂酰胆碱LPC和心磷脂CL。