[发明专利]一种用于预测NSCLC患者度伐利尤单抗治疗疗效的生物标志物

说明书

本发明预测在非小细胞肺癌患者中度伐利尤单抗治疗疗效的的生物标志物，同时预测度伐利尤单抗在治疗非小细胞肺癌疗效的应用，上述研究为血液外泌体PD‑L1作为抗PD‑L1疗效预测的生物标志物的应用提供了一定理论基础。

技术领域

本发明涉及生物研究领域，特别涉及肿瘤细胞免疫治疗。

背景技术

细胞程序性死亡配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)，又称B7同源体(B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。有研究证实PD-L1在多种肿瘤细胞中高表达，其与T细胞上的PD-1受体相互结合进而下调抗肿瘤免疫反应，肿瘤细胞可通过上调PD-L1的表达来逃避免疫监视。近些年，针对免疫检查点PD-1/PD-L1的免疫治疗作为一种新的肿瘤治疗手段，在多种恶性肿瘤的治疗中显示出较好的应用前景。

外泌体是一种直径30-150nm的小纳米颗粒，具脂质双层膜结构，它们携带肿瘤细胞的蛋白质、microRNA、RNA、DNA等多种成分，通过与细胞膜融合，将信息传入受体细胞，从而参与肿瘤和多种细胞之间的物质传递。有多项研究表明，外泌体PD-L1(exosomal PD-L1，ePD-L1)具有免疫抑制作用，包括抑制T细胞活化、促进T细胞凋亡、抑制免疫记忆。

非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC),肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％-85％，其主要的致癌因素有吸烟、电离辐射、既往肺部慢性感染和遗传等因素。目前主要的治疗手段包括外科治疗，放射治疗、化学治疗等，约75％的患者确诊时已处于中晚期，5年生存率很低。

肿瘤组织PD-L1的表达水平检测是目前被广泛用于选择患者是否适合接受抗PD-1/PD-L1治疗，目前检测肿瘤组织中PD-L1表达水平的主要方法是免疫组织化学检测法(Immunohistochemistry，IHC)，其取材方式属于有创操作，会对患者造成较大负担。此外检测抗体、检测平台、组织质量、阳性阈值、组织异质性等和肿瘤细胞PD-L1的动态表达都会导致PD-L1检测结果存在不准确。因此，肿瘤组织免疫组织化学法检测PD-L1表达水平存在一定的局限性。

发明内容

本发明的目的在于通过预测在非小细胞肺癌患者中度伐利尤单抗治疗疗效，同时通过预测在非小细胞肺癌患者使用度伐利尤单抗后CEA，CA19-9，CYFRA21血清肿瘤标志物的表达水平来进一步评估治疗效果。

收集医院40例非小细胞肺癌样本，病理诊断都是肺癌III期，临床样本有严格的纳入标准，经详细说明研究目的后所有患者均知情同意参与本研究。患者用药前收集一次血样作为基准线，在随后的用药治疗的4个疗程中(3个月，6个月，9个月和12个月)各收集一次患者血样。

从非小细胞肺癌患者血液中提取外泌体，用透射电子显微镜观察外泌体的超微结构并拍照。通过Western blot实验检测外泌体表面标记蛋白CD9、CD63、TSG101和Alix的表达情况。

通过ELISA检测用药前非小细胞肺癌患者血液外泌体中PD-L1的含量。计算所有患者的ePD-L1表达量的平均值，根据平均值对所有将患者进行分组，分为高/低表达两组,分析不同血液外泌体PD-L1表达量患者的客观反映率，接着根据受试者工作特征曲线(ROC)曲线来预测anti-PD-L1的治疗效果的准确性。

通过ELISA检测非小细胞肺癌患者接受4个疗程(12个月)durvalumab药物治疗的血清肿瘤标志物的含量变化。

附图说明

图1：透射电子显微镜观察从非小细胞肺癌患者外周血中提取的外泌体的超微结构。

图2：从提取的血液外泌体样本中随机选取4例通过western blot检测外泌体表面标记蛋白CD9、CD63、TSG101和Alix的表达情况