[发明专利]一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供了一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法。该试剂盒为基于MIRA荧光法的人腺病毒7型核酸检测试剂盒。其中，MIRA的引物是根据腺病毒7型hexon基因特异序列设计的，本发明提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒及其使用方法。

技术领域

本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

人腺病毒(human adenovirus，HAdV)是无包膜的双链DNA病毒，根据感染性中和反应，HAdV可分为57个血清型，又根据核酸的同源性、纤维蛋白的特异性和抗原决定簇，目前鉴定的57个血清型又分为A～G 7个亚属，A、F和G主要引起消化道感染、腹泻，C、E和部分B亚属主要引起呼吸道感染，其他B亚属主要引起尿路感染，D亚属只要引起角膜炎和结膜炎。并且由于其基因组的重组和变异，新的型别还在不断地出现，某些型别可引起爆发流行。人感染HAdV可导致多种疾病，包括上呼吸道感染、支气管炎、肺炎、结膜炎、急性出血性膀胱炎等。急性呼吸道感染患者阳性率为5.7％-6.36％。报道显示HAdV感染人群主要集中3～6岁，中位年龄为4岁6月。5岁以下儿童占58.73％。学龄前儿童检出率最高，其次是婴幼儿和学龄儿童。传播途径主要是经空气飞沫传播。因此，准确鉴定和区分人腺病毒的血清型对于确定和优化治疗方案以及抑制病原菌的传播具有重要意义。

传统的检测方法包括病毒分离鉴定、免疫荧光和普通PCR检测法，存在成本高、耗时长，有假阳性等问题，不能及时为防疫部门提供病原学依据。为此我们根据人腺病毒7型六邻体(hexon)基因高度保守区设计引物和MIRA探针，建立一种快速、特异、敏感的腺病毒检测方法，对快速预警腺病毒爆发具有重要意义。

近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。

MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。MIRA技术具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原体的检测中。

针对现有技术中存在的问题，本发明研发并评估了多酶快速恒温扩增荧光MIRA法作为人腺病毒7型核酸检测的试剂盒。

发明内容

因此，本发明为了解决上述技术问题中的至少一个，提供了一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法，该试剂盒能够节约反应时间，反应温度要求低。

根据本公开的第一方面，提供了一种引物组合，用于扩增包括腺病毒7型hexon基因序列的扩增片段，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其中，

所述第一引物的序列为：

ATCATCACCACGCCGCCGCAGCAGAGGAGAAAG；

所述第二引物的序列为：

GTGTCTGTTGCACGGGCGAACTGCACCAGACCC。

在一些可能的实施方式中，还包括第三引物，所述第三引物的序列为：